Cromatografía de líquidos preparativa

La cromatografía se define como la separación de una mezcla en función de los atributos químicos de los componentes de dicha mezcla. La cromatografía preparativa (Prep) o de purificación se define como el proceso de utilizar cromatografía para aislar un compuesto en una cantidad y con un nivel de pureza suficientes para experimentos o procesos posteriores. Un científico determina un compuesto de interés y, después, desarrolla un método para separar y aislar con éxito ese compuesto de los materiales de partida, las reacciones secundarias y otras impurezas. El objetivo general es satisfacer las crecientes necesidades de alto rendimiento y productividad, adaptando al mismo tiempo las técnicas de purificación para satisfacer los requisitos de escala, pureza y reproducibilidad adecuados.

La cromatografía de purificación se utiliza en muchos entornos científicos, desde grandes organizaciones farmacéuticas hasta pequeños grupos de investigación de productos naturales. Aunque las áreas de aplicación pueden variar, los requisitos generales del usuario son bastante similares, con un nivel de pureza final deseado del 95 % o más para el aislamiento objetivo.

La intención de este documento es proporcionar a los cromatografistas de líquidos información introductoria sobre el campo en rápida expansión de la purificación por LC. Se introducen principios básicos como el desarrollo de un método de separación cromatográfica, las ecuaciones matemáticas necesarias para el escalado del método y los modos más utilizados para la recolección de fracciones. La fase reversa es el principal modo de separación analizado, ya que se utiliza en la mayoría de las aplicaciones de LC preparativa.

El éxito de un aislamiento de purificación está determinado por el rendimiento, la recuperación y la pureza del producto aislado obtenido. El aislamiento depende de la separación o la «resolución» de los picos. Los siguientes parámetros cromatográficos tienen el impacto más significativo en la resolución:

• Material de relleno de la columna (fase estacionaria)
• Fuerza de los eluyentes

Las condiciones que proporcionan una resolución óptima se determinan mediante un flujo de trabajo de desarrollo de métodos. El flujo de trabajo es bastante simple, pero consta de varios pasos, cuya complejidad y necesidad varían en función de las propiedades únicas de cada muestra. Independientemente de la aplicación o el modo de separación de las muestras (es decir, fase reversa, intercambio iónico, etc.), el flujo de trabajo será normalmente el mismo.

El factor más importante a considerar antes de diseñar un flujo de trabajo es la naturaleza del compuesto diana. Al aislar un compuesto conocido de la misma fuente o de una nueva, es fácil obtener información bibliográfica sobre el comportamiento cromatográfico del compuesto diana y se puede seleccionar con poca dificultad el método adecuado para el aislamiento a partir de métodos previamente publicados. Sin embargo, es más difícil diseñar un protocolo de aislamiento para un extracto crudo en el que se desconocen los tipos de compuestos. En este caso, se pueden realizar una serie de experimentos exploratorios después del aislamiento inicial para obtener más información sobre el compuesto de interés, como el pK_a, el peso molecular, la solubilidad, la estabilidad, los espectros de UV y la actividad biológica. A partir de esta información, se puede modificar el método de separación inicial para cumplir con los requisitos químicos y físicos del compuesto. Esta información no solo es útil para el desarrollo de métodos, sino que también es valiosa después de la recolección cuando la estabilidad del producto aislado cobra importancia.

El primer paso es preparar una muestra y realizar una separación general utilizando un gradiente de exploración rápido. Esto se suele realizar a pequeña escala para conservar el valioso material de muestra. A partir de esta separación, se puede calcular el porcentaje de eluyente que eluye el compuesto de interés y optimizar aún más las condiciones de separación para maximizar la resolución. También se puede realizar un estudio de carga para determinar cuánta muestra se puede cargar mientras se mantiene una resolución adecuada para producir un producto aislado de alta pureza.

Una vez que se han establecido el método de separación y la carga de muestra deseada, a menudo, aunque no siempre, se realiza el escalado del método para cualquier producto aislado con valor prometedor o potencial. El término «escala» para los fines de este documento está destinado a describir la instrumentación y la metodología necesarias para alcanzar los objetivos de pureza, producción y rendimiento de la aplicación. Cuando se «escala» un método, se traslada a un sistema con hardware adecuado para manejar cargas de muestra más altas. Básicamente, el escalado implica pasar de una columna de diámetro analítico a preparativo, manteniendo la resolución a través de una serie de cálculos de escalado y cambios de hardware.

Muestras

Las muestras de las que se puede aislar un compuesto concreto proceden de una amplia gama de fuentes, incluidos fármacos intermedios, productos naturales, nutracéuticos, bebidas o productos industriales. Siempre que un material se pueda extraer y disolver en una matriz líquida, los componentes individuales se pueden purificar mediante cromatografía.

Las técnicas utilizadas para la extracción de muestras dependen de la complejidad del material del que se extrae. En el caso de los productos naturales, la muestra se seca y se muele en partículas finas para aumentar la eficacia de la extracción. A continuación, se puede utilizar una técnica como la percolación, para tamaños de muestra grandes, o la maceración, para tamaños de muestra pequeños, para extraer los compuestos de interés. Ambas técnicas implican añadir un eluyente al material de la muestra y recoger el soluto tras la sonicación, agitación o inmersión. Una vez recogido el extracto, como ocurre con todas las muestras de HPLC, debe filtrarse para eliminar las partículas y eliminar las burbujas antes de la inyección.

Modos de separación

Hay cuatro modos principales de separación que se utilizan en la cromatografía preparativa. Estos incluyen la fase reversa, la fase normal, la permeación en gel y el intercambio iónico. El modo de separación adecuado se determina por la compatibilidad de la fase estacionaria y los eluyentes con la muestra, el extracto o la mezcla que se analiza.

La fase reversa, la técnica más utilizada para el desarrollo de la purificación, utiliza una fase estacionaria que es menos polar que el eluyente de elución. El eluyente es una mezcla de agua y acetonitrilo o metanol, mientras que se añaden tampones (ácidos o bases) para controlar el grado de ionización de la muestra y ocupar los grupos silanol libres sin reaccionar presentes en la fase estacionaria. Los materiales de la fase enlazada o los sorbentes en las fases estacionarias basadas en sílice se derivan con reactivos de alquilsililo para reducir la asimetría de picos y mejorar la reproducibilidad cromatográfica. El grado de carga de carbono con estos reactivos derivatizados (silianización) puede proporcionar características de separación únicas a las columnas de diferentes fabricantes.

Desarrollo del método de inicio rápido

Para establecer una separación de fase reversa, a menudo se selecciona una columna analítica a pequeña escala (≤4,6 mm de diámetro) con una longitud y material de relleno disponibles en gran escala (≥10 mm de diámetro) para facilitar el futuro escalado. Es esencial encontrar el sistema de eluyentes correcto para lograr una separación óptima. Para los compuestos ácidos, generalmente se prepara una fase móvil acuosa a un pH ácido, mientras que se prepara metanol o acetonitrilo como eluyente fuerte. El ácido fórmico, igual al 0,1 % en concentración, es un aditivo tampón de uso común porque es compatible tanto con la espectrometría de masas como con UV. La compatibilidad con MS es útil para identificar compuestos desconocidos y para preparar un producto aislado purificado para su posterior estudio. Se puede utilizar una fase móvil de pH básico en lugar de pH ácido para mantener la forma no ionizada de las moléculas básicas. Se debe consultar el prospecto de la fase estacionaria de la columna para verificar la compatibilidad antes de utilizar un tampón a cualquier pH.

Normalmente, la fase móvil acuosa se coloca en la posición A de la bomba y el eluyente fuerte se coloca en la posición B de la bomba. «A» y «B» se utilizarán en este documento para hacer referencia a los eluyentes acuoso y fuerte en las tablas de la bomba, respectivamente.