Cromatografía de líquidos preparativa

La inyección de la muestra se puede realizar manualmente para un rendimiento bajo, o automatizar para aplicaciones de alto rendimiento. En la inyección manual, se retira una válvula Rheodyne equipada con un bucle de inyección de la trayectoria del flujo girando la palanca de la válvula. Se introduce una muestra filtrada en una jeringa, se coloca una punta de aguja roma y se eliminan las burbujas de aire. La aguja se inserta en el puerto de inyección de la muestra y la muestra se dispensa en el bucle de inyección. La palanca de la válvula Rheodyne se gira para volver a colocar el bucle de inyección en la trayectoria del flujo. En esta posición, la muestra se introduce en la trayectoria de flujo.

La inyección de muestra también se puede automatizar para un alto rendimiento. Los inyectores automáticos de alta capacidad pueden gestionar la aspiración y la inyección de muestras en una única plataforma. Se ha configurado un brazo robótico en el software de purificación para controlar la inyección de muestras procedentes de placas de microtitulación, tubos de ensayo, viales de centelleo o viales para inyectores automáticos convencionales.

Bucles de inyección

Normalmente, un bucle de inyección se selecciona en función del tamaño del volumen de inyección previsto. Cuando el volumen del bucle es demasiado grande, la muestra puede absorberse hasta el área de superficie sobrante del bucle, lo que provoca un retardo, o puede producirse la dispersión de la muestra. Ambas situaciones pueden afectar negativamente a la calidad de la cromatografía. Un tamaño de bucle cercano al volumen de inyección previsto proporciona la mejor reproducibilidad y perfil cromatográfico.

Colectores de fracciones

El rendimiento deseado para la aplicación determina el nivel de automatización necesario para la recolección de fracciones. Un colector de fracciones consta de un interruptor y una válvula divisora de muestras. La válvula divisora se abre en el momento adecuado para permitir que los compuestos se recojan a medida que se eluyen.

Si bien la recolección de fracciones se puede realizar manualmente para aplicaciones de bajo rendimiento, también se puede automatizar para un mayor rendimiento. El nivel de automatización está determinado por el número y el volumen de fracciones deseadas. Los colectores de fracciones de alto rendimiento a menudo combinan la inyección de muestras y la recolección de fracciones en la misma mesa de trabajo utilizando un brazo robótico equipado con sondas de recolección de muestras y de fracciones.

Recipientes de recogida

Muchos sistemas de purificación admiten una amplia gama de formas, tamaños y volúmenes de recipientes de recogida. Los recipientes de recogida más habituales incluyen tubos de ensayo, viales, botellas o embudos que se dispensan en recipientes grandes. Los recipientes de recogida deben estar limpios, secos e inertes cuando se exponen a la muestra y al eluyente. Por lo general, se colocan en el lecho de recogida de recipientes sin un cierre superior para permitir la dispensación del producto aislado.

En algunos sistemas de recogida, las fracciones que no se recogen no se desechan, sino que pueden ir a un recipiente de residuos específico para la muestra. Si el usuario recoge el pico incorrecto, ejecuta un método inapropiado, no detecta el objetivo o no se activa la recogida, fluirá a un recipiente de desechos especial desde el que el eluyente se puede evaporar y la muestra se vuelve a disolver y a inyectar.

Detectores

Se deben tener en cuenta consideraciones especiales para la detección al realizar la cromatografía de purificación. Los cuatro tipos principales de detectores utilizados para la purificación son UV/Vis, índice de refracción (RI), light scattering evaporativo (ELS) y espectrometría de masas (MS).

Los detectores pueden detectar en una sola longitud de onda que el usuario puede configurar (UV/Vis), o la absorbancia en un intervalo de longitudes de onda puede ser recogida por un detector de matriz de fotodiodos (PDA). El PDA se utiliza a menudo durante el desarrollo de métodos para seleccionar una longitud de onda adecuada para el compuesto de interés. Esto se logra recogiendo longitudes de onda entre 200 y 400 nm o mayores (≥350 nm) cuando se trabaja en el intervalo visible. La longitud de onda que proporciona la máxima intensidad de la señal para el compuesto de interés es la longitud de onda óptima para el aislamiento. También se debe determinar la longitud de onda óptima para las impurezas que eluyen muy cerca. De lo contrario, un «producto aislado puro» recogido a una longitud de onda determinada puede contener impurezas cuando se observa en una longitud de onda diferente. Cuando esto ocurre, puede ser necesario el desarrollo de un método secundario y una purificación para purificar aún más el producto aislado.

Cuando se utilizan detectores UV/Vis y PDA, la alta sensibilidad puede ser un obstáculo para los grandes volúmenes de inyección y las altas concentraciones de muestra habituales durante la purificación. Como resultado, se utilizan celdas de flujo del detector con caminos ópticos cortos (1-3 mm) en lugar de celdas de flujo analítico con caminos ópticos largos (10 mm).

Los detectores RI cuentan con algunas ventajas para la detección de componentes con absorción UV limitada o nula, como alcoholes, azúcares, sacáridos, ácidos grasos y polímeros. El detector RI detecta diferencias en el índice de refracción para determinar la presencia o ausencia de un compuesto. El detector RI a veces se denomina detector «universal» porque no depende del compuesto ionizado ni contiene un cromóforo. Una desventaja del detector RI es que solo se puede utilizar en separaciones isocráticas para evitar la detección de perturbaciones en el gradiente que provocan la deriva de la línea base.

Los detectores ELS se pueden utilizar como alternativa a los detectores UV/Vis y RI. Los detectores ELS funcionan haciendo pasar el eluato a través de un nebulizador calentado para volatilizar el analito y evaporar el eluyente. El eluyente es arrastrado como un gas, pero el analito forma una corriente de partículas finas que pasa entre una fuente de luz y un detector que dispersa la luz y mide el efecto. Las principales ventajas de los detectores ELS son que detectan compuestos que no poseen cromóforo y pueden utilizarse tanto en separaciones isocráticas como en gradiente. Una desventaja es que los detectores ELS destruyen las muestras, por lo que el detector no se puede poner en línea con la trayectoria de flujo principal. La trayectoria del flujo debe dividirse para que una pequeña proporción vaya al detector ELS y el resto al colector de fracciones.

Los detectores de MS identifican los compuestos de muestra separados que surgen de la columna en función de su masa y del espectrómetro de masas. MS es uno de los métodos de análisis molecular más sensibles y altamente selectivos, y proporciona información sobre el peso molecular y el patrón de fragmentación de la molécula del analito, lo que resulta muy valioso para confirmar la identidad del analito. Se dispone de varios tipos de sistemas MS que incorporan diferentes tipos de interfaces. Las interfaces más utilizadas son la electrospray (ESI) y la ionización química a presión atmosférica (APCI). Cada interfaz está asociada con diferentes campos de aplicabilidad, capacidad de caudal, sensibilidad y linealidad de respuesta. Al igual que los detectores ELS, la MS es una técnica destructiva, por lo que el flujo debe dividirse para que una pequeña parte entre en el detector y la parte principal en el colector de fracciones.

Divisores de caudal

En el caso de los detectores químicamente destructivos, como los de MS o ELS, una parte del flujo procedente de la columna debe separarse de la corriente de flujo principal para ir al detector para la activación de fracciones. Ya que los detectores deben detectar un pico antes de que se active el colector de fracciones (tiempo de retardo), la división de flujo debe llegar al detector antes de que el flujo principal llegue al colector de fracciones. Para lograrlo, la velocidad de la división de flujo se aumenta utilizando una «bomba auxiliar» y un «eluyente auxiliar».

La división de flujo puede ser «pasiva» o «activa». Tanto las divisiones de flujo pasivas como los activas son igualmente eficaces para tomar muestras del flujo de muestra principal, por lo que el tipo de divisor que se utilice depende de las preferencias del usuario.

Los divisores pasivos implican el uso de tubos restrictivos, como un serpentín de retardo y «conectores en T», para mantener un flujo de operación y una proporción de división específicos.

Un divisor de caudal activo tiene dos trayectorias de flujo completamente separadas y una válvula de conmutación rápida que transfiere una parte de la trayectoria del flujo principal al flujo auxiliar, donde se diluye en una proporción de división programada.

Tubos

Al decidir el tubo adecuado que se utilizará para la trayectoria de fluidos, hay que tener en cuenta varias consideraciones. En primer lugar, garantizar la integridad de los tubos de la trayectoria del flujo del sistema depende en gran medida de la idoneidad del material con el que se fabrican los tubos y de la aplicación. El tubo puede estar hecho de un polímero de alto rendimiento de PEEK (poliéter éter cetona) o de acero inoxidable, y debe ser químicamente compatible con la muestra y la fase móvil para evitar que la muestra se pegue a la superficie del tubo, lo que puede provocar la pérdida de muestra, bajo rendimiento o arrastre.

Los tubos del sistema también deben ser capaces de soportar las presiones y temperaturas de funcionamiento de la trayectoria del flujo, aunque con la cromatografía de purificación, a menudo no se utiliza el control de la temperatura de la trayectoria de fluidos y, por lo tanto, no supone un problema importante.

Al considerar las limitaciones de presión, los sistemas de purificación cromatográfica se pueden separar en tres zonas: la zona de «baja presión» entre el recipiente de eluyente y la bomba; la zona de «alta presión» entre la bomba y la entrada de la columna; y una segunda zona de «baja presión» entre la salida de la columna y el recipiente de desechos o colector de fracciones después del detector. El tubo de cada zona tiene requisitos únicos de mantenimiento de la presión. La selección de un material del tubo inadecuado en una zona de presión con requisitos críticos puede conducir no solo a un rendimiento deficiente y problemas cromatográficos, sino también a fugas y rupturas.

Se deben considerar dos variables: el diámetro interno del tubo y su longitud. Por lo general, cuanto menor es el diámetro interno, más rápida es la velocidad interna y menor es la dispersión de la muestra, lo que permite que la muestra permanezca lo más concentrada posible. Sin embargo, a medida que disminuye el diámetro del tubo interno, la presión creada por el tubo puede aumentar significativamente, lo que puede dar lugar a una contrapresión del sistema incompatible con la celda de flujo del detector o con otros componentes del sistema. Cuando se conectan tramos del tubo con diferentes diámetros internos, se puede formar un volumen muerto en la unión o cerca de ella. Este volumen muerto puede causar problemas de forma de pico y arrastre, ya que los volúmenes no son arrastrados de forma adecuada por el fluido o la fase móvil.

Al considerar la longitud del tubo, cuanto mayor sea el volumen de la trayectoria del flujo, mayor será la posibilidad de que la muestra se diluya en la fase móvil y de que los componentes separados se vuelvan a fusionar. La longitud del tubo también puede contribuir a las presiones del sistema, a los volúmenes de retardo y a los volúmenes extracolumna. Para evitar estos problemas, la longitud del tubo.

Los sistemas de purificación preparativos a gran escala suelen funcionar a caudales elevados. Para moderar la contrapresión causada por estos caudales, es importante conectar el sistema de purificación con tubos de diámetro adecuado para garantizar resultados cromatográficos de alta calidad. Se ofrece una gama de diámetros de tubo para caudales desde 0,05 mL/min hasta 130 mL/min.