胜肽分離實用方法

管柱選擇

理想情況下，如果所有樣品（包括普通胜肽（酸性、鹼性和非極性殘基的混合物）、鹼性胜肽、大分子胜肽（30–40個殘基）和疏水胜肽）都使用一種管柱，可以減少管柱庫存量，無需為每個未純化樣品篩析多個管柱。雖然C₁₈固定相通常用於許多胜肽分離，不過與C₁₈鍵結的基質顆粒也是會影響層析滯留性、解析度和峰型的關鍵因素。XBridge BEH胜肽分析管柱的基質顆粒是乙基架橋雜化顆粒，並不是純矽膠。BEH（乙基矽氧烷/矽膠架橋雜化）顆粒（圖7）能將管柱與胜肽的二次交互作用降到最低，在pH值高和低的情況下都很穩定，讓開發分離方法能發揮最大的靈活性。合成填充材料提供130 Å或300 Å孔隙規格，粒徑大小包括3.5、5和10 µm。若要用於非典型的樣品或極度疏水的胜肽，同樣的基質顆粒亦提供C₈或C₄鍵結相。

表1顯示不同管柱尺寸上近似的胜肽上樣量。

表1.逆相層析的近似胜肽上樣量

* 5 µm和10 µm OBD製備級管柱；** 10 µm OBD製備級管柱。

許多因素皆會影響製備級管柱的載樣量，列出的載樣量代表每個尺寸的管柱採用合理流速和注射量時的「平均」估計值。以下因素值得考慮：
1)胜肽的載樣量主要取決於特定樣品的溶解度。
2)在需要更高解析度的情況下，載樣量越低。
3)載樣量取決於上樣條件，但小分子較少受此影響。
a)胜肽通常會在高水性條件下上樣，一般會添加TFA。在這些條件下的上樣量實際上是無限的。載樣量受限於洗脫過程中的溶解度。
b)乾燥的胜肽可以使用DMF或DMSO等溶劑來潤濕。如上所述，通常隨後會以含有TFA的水來稀釋它們。
c)在某些情況下，胜肽會溶解於DMF或DMSO中，注射時亦採用該溶液。圖表中的體積準則適用於這種情況。
4)合理的注射量取決於50 mm管柱的直徑和相對強的溶劑。增加長度能與更大的注射量相容，但不一定成正比。較弱的溶劑會大大增加注射量。
5)合理的流速取決於管柱直徑。系統會受到隨管柱長度增加和粒徑縮減而背壓上漲的限制。有的使用者喜歡用比小分子分析更慢的速度來分析胜肽，因此會使用建議流速的一半，但梯度持續時間加倍的方式。

XBridge BEH C₁₈ 130 Å胜肽分析管柱作為標準胜肽分離的首選管柱，是經由試驗一組四種不同特性胜肽後所得出的結果來決定的。胜肽序列為Waters專有資訊，但每個胜肽的顯著特性列於表2。

表2.胜肽試驗組特性。

由於同時存在弱酸性（羧酸）和弱鹼性（胺基）官能基，因此胜肽屬於兩性。因為胜肽具有正電荷和負電荷，所以也稱為兩性離子。如果胜肽溶解在含有特定氫離子濃度的溶液中，在電場作用下不會遷移，則該氫離子濃度就是該胜肽的等電點(pI)。所以簡而言之，等電點(pI)就是胜肽具有零淨電荷的pH值。

如Browne、Bennet和Solomon所述，HPLC指數可以預測使用TFA:水:乙腈作為緩衝體系，從C₁₈ µBondapak管柱中洗脫胜肽所需的乙腈百分比。他們從生物基質中分離胜肽，並根據胺基酸組成來預測洗脫特性。因此，高HPLC指數值表示胜肽在C₁₈管柱中的疏水性高。顯然，這些值會隨著不同的管柱和移動相而改變，但這套簡單的系統可以提供一些關於胜肽性質的預測資訊。

圖8是試驗組中四種胜肽於極為常見條件下的層析圖，也就是0.1%甲酸的水溶液和乙腈溶液，梯度為50 min內5%–50% B。這四種模型胜肽都呈現出完全可接受的層析分離峰，既尖銳又對稱。

請務必要考慮使用300 Å孔隙大小的管柱是否會讓大分子胜肽或疏水胜肽的層析分離有任何改善。胜肽試驗組中最大的胜肽含有39個殘基，分子量超過4000 Da，在使用孔隙較大的填料時，峰型幾乎沒有改善（圖9）。胜肽會稍微早點洗脫出來，差異相當於約1%–2%乙腈。使用130 Å孔隙大小的填料會對分子大小有一些限制。通常要求殘基數量多於約40個。

HPLC指數為113的疏水胜肽，也會在130 Å和300 Å兩種填料上洗脫成尖銳對稱的波峰（圖10）。胜肽構形（亦即胜肽在溶液中折疊的方式）也可能影響特定分離的最佳孔隙大小選擇。正如胜肽上樣量沒有直接的硬性規定一樣，各個胜肽的特性也可以用來決定要使用的最佳孔隙大小。從上述討論的實驗中可以看出，XBridge BEH胜肽分析管柱具有C₁₈鍵結相和130 Å孔隙面積，因此可以作為胜肽分離的起點。

以大規模進行胜肽分離的經濟性和效率角度來看，考慮粒徑大小是很重要的。在三個不同粒徑大小的管柱上分析的鹼性胜肽說明了分離的一致性（圖11）。雖然粒徑越大，波峰會越寬，且解析度越差，但對於可擴充的BEH管柱填料而言，無論粒徑是3.5、5還是10 µm，化學選擇性都不變。粒徑變大有益於大規模分離，在可調控壓力限制的管柱上，當直徑越來越寬時，可達到的流速會更快，這些都能提高上樣量，減少層析分離運作的次數，並節省時間和資源。

雖然胜肽獨有的特性會影響其未純化混合物分離成功與否，不過製備級層析分離的基本原理仍然適用。標準的胜肽分離實驗步驟是在逆相管柱上運行通用梯度（例如5%–50% B或5%–95% B），雖然多數時候都可行，可是具有獨特性質的胜肽有時需要開發新的分離方法，才能實現純度、上樣量或產量的要求。分離方法通常可以藉由改變移動相溶劑、修飾劑、梯度斜率、溫度、pH或樣品引入方法來改進。這些一個個因素都會影響分離處理、層析分離品質和分離最終的成敗。

溶劑作用

移動相由弱溶劑、強溶劑和修飾劑三種成分組成。在逆相層析中，弱溶劑幾乎都會是水。雖然甲醇、乙醇或異丙醇可以考慮作為強溶劑，不過乙腈通常才是首選，因為它的黏度低、溶劑強度稍高，而且可用於短波長紫外偵測範圍(185–205 nm)。乙腈通常可形成最佳峰型，它易於蒸發，還能減少分離和後處理過程中可能發生的副反應。良好的紫外線透明度可提供高訊噪比，更有效偵測波峰。可是若有些使用者想在生物試驗中使用胜肽，可能會反對使用乙腈。

以醇類（如乙醇）代替乙腈，可降低可能與乙腈有關的殘留毒性。除了對生物相容性有所疑慮之餘，丙醇或乙腈:丙醇混合物通常會讓大分子胜肽或疏水胜肽溶解度提高，還能分解有時在溶液中形成的聚集體。70%異丙醇:30%乙腈對鹼性胜肽的影響如圖12所示。主峰相對於最接近它洗脫的污染物的解析度有所改善，滯留時間縮短了大約一半。含有醇類的移動相由於黏度較高，通常需要提高管柱溫度。

移動相修飾劑的作用

使用逆相層析方法的胜肽分離作業，需要在移動相中添加極性修飾劑，因為胜肽同時具有正（胺基末端）和負（羧基末端）電荷，這會降低胜肽對填充材料疏水表面的親和力。側鏈保護基也會帶有電荷，如圖13所示。修飾劑會控制pH值來改變弱酸性或鹼性側鏈的游離程度。修飾劑也可以與胜肽形成離子對。特定樣品的分離可以操作這些機制來發揮最佳效果。

甲酸會降低移動相的pH值，讓胜肽上的酸性側鏈質子化，並去除一些負電荷（圖14）。帶電胺基酸側鏈數量減少，會增加對管柱疏水表面的吸引力，促進更有效的分離。雖然管柱表面上大多數矽醇基也可能會質子化，但仍有可與胜肽鍵結的遊離矽醇。這些胜肽-矽醇交互作用會在層析圖中顯示為拖尾峰。

三氟乙酸(TFA)是最常用的修飾劑，它與管柱和樣品的交互作用機制不同（圖15）。低pH值會讓酸性胜肽側鏈質子化，離子配對則會中和鹼性側鏈，抑制其與游離矽醇結合，避免造成拖尾峰。電荷減少的情況下再加上離子對，會增加滯留性，因此需要更高濃度的有機溶劑進行洗脫。

使用乙基架橋雜化顆粒的管柱，好處是能消除矽醇的交互作用（圖16）。不再需要TFA來減少拖尾峰，因為基質填料與胜肽的交互作用較少。可以轉而使用甲酸(FA)或TFA來改變分離的選擇性，同時保持良好的峰型。滯留性的差異以及洗脫順序的變化，可用於調整純化製備條件，如圖17所示。星號標識出兩次分離的胜肽污染物都相同，證實選擇性的確有顯著和有用的變化。

升高pH值的作用

提高pH值也可用於改變胜肽與乙基架橋雜化管柱表面之間的交互作用。使用碳酸氫銨等緩衝液時，高pH會讓酸性胜肽側鏈去質子化和游離（圖18）。碳酸氫銨還會讓鹼性胜肽側鏈去質子化並中和，進而降低胜肽的電荷，增加其對疏水管柱表面的吸引力。鹼性胜肽側鏈不會與剩餘的少量殘留矽醇結合，因此峰拖尾峰現象就會減少。除了這些好處之外，碳酸氫銨有揮發性，相對容易從純化製備的胜肽產物中去除。0.1%的氫氧化銨也可用來提高移動相的pH值，而且很容易從收集的餾分中蒸發。

pH極端值會改變分離的選擇性（圖19和20）。酸性胜肽（圖19）在低pH值條件下更能滯留在逆相填料上，因為所有負電荷都會被中和，胜肽與疏水管柱表面會產生強烈的交互作用。另一方面，在高pH值條件下，由於負電荷更多，胜肽的滯留時間會前移，因此無法強烈吸附在管柱填料上。在此範例中，峰型並不受影響，但洗脫順序的變化可用於方法開發，或使用正交策略來對胜肽進行表徵分析。

正如預料，鹼性胜肽（圖20）在pH極端值下表現出相反的行為。在高pH值下，胜肽的鹼性殘基會去質子化且不游離。胜肽與管柱的強烈交互作用，會需要更高百分比的有機移動相才能使其從管柱中洗脫下來。在pH為10的情況下，選擇性發生了變化，解析度亦有所提高，因此高pH值對分離高純度胜肽的最終目標更有吸引力。

提醒：雖然pH值高和低的移動相都能與雜化顆粒技術管柱相容，但在pH極端值的方法條件下，不得使用矽膠管柱填料。pH值過低會裂解鍵結相。高pH值會破壞矽膠顆粒管柱的基質。請一律查詢製造商對特定矽膠管柱的建議pH範圍限制。

溫度的作用

溫度控制最常用於層析分離，確保得出可再現的結果。在分離和純化中，溫度控制之所以有價值也因為其他數個原因。溶解度有限的疏水胜肽是最難純化的樣品之一。提高分離溫度會增加疏水胜肽的溶解度，通常能改善其層析分離的峰型。最後會提高分離的純度和回收率，讓分離更快速、更有效率。

由於不同的溫度會產生不同的層析分離選擇性，因此管柱加熱是最佳化特定樣品分離的一種非常方便的工具。此外，移動相黏度和系統總壓力會隨溫度升高而降低。較低的系統壓力可減少系統、接頭和管柱的壓力，最後提高操作的耐用性。

雖然分析級層析分離中的溫度控制是常規做法，但溫度很少會當成是操作製備級層析分離的參數，原因有二。首先，直徑大的管柱無法從外部均勻加熱。其次，高流速分離實際上是在輸入溶劑的溫度下發生的。電熱毯和管柱烘箱雖然對小規模分離來說即足夠，但卻不能均勻加熱大型管柱。管柱的直徑和長度方向上會形成溫度梯度，對層析分離產生不利影響。

有效的管柱加熱方式是，在管柱頭部插入溶劑預熱環，並將此環和管柱完全浸入能平衡至所需溫度的水浴中（圖21）。連續流動的溶劑會經過預熱環，讓管柱內部溫度達到平衡，而水浴則穩定外部管柱環境。因溶劑預熱環所致的譜帶擴散現象可以忽略不計，因為它由狹窄內徑的管路構成。輸入的樣品也會吸附至管柱頭部而重新聚集起來。

下圖顯示使用溫度控制進行胜肽分離的效果，兩個試驗組胜肽分別為鹼性胜肽（圖22）和酸性胜肽（圖23）。在這些範例中（以紅色強調顯示），鹼性胜肽的樣品成分在60 °C下可以分離得更有效，而酸性胜肽的未純化混合物成分則在40 °C下可以分離得更有效。可是，這些觀察結果純屬巧合，因為要預測酸性或鹼性胜肽的最佳溫度幾乎是不可能，得取決於各個序列的特性。

改變溶劑、移動相修飾劑、pH值和溫度都會大大影響胜肽的分離，其中任何一個參數都可以單獨使用，也可相互搭配成最佳化層析分離的方法開發工具。選擇填充了穩定雜化顆粒的管柱，例如XBridge BEH胜肽分析管柱技術，可以減少胜肽分離所需的管柱數量，縮短篩析時間，藉此讓純化的過程變得更簡單。圖24中鹼性胜肽的層析圖指出微小變化對分離的影響。若是具有獨特性質的胜肽，其他管柱充填材料可能有助於發揮最佳的分離作用。

聚焦梯度

用於分離和純化的層析分離，要按照跟分析級分離同樣的物理和化學原理。可是在製備級實驗中，科學家通常會在大型管柱上以高上樣量來分離化合物，而且需要更高的解析度來提高所收集產物的純度和回收率。形成平緩梯度，是提高解析度的第一種方法，但改變整個分離處理的梯度斜率，會讓波峰變寬並延長總運作時間。分段和聚焦梯度只會降低分離處理中需要提高解析度部分的梯度斜率，而不會延長總運作時間（圖25和26）。

有機溶劑成分在規定的一段時間內從低變成高（即5%–50% B或5%–95% B）的線性梯度通常用於樣品篩析。如果樣品成分之間有良好的解析度，而且運作時間相當短，也可以用於製備級層析分離。分段梯度會在較平緩的部分（聚焦部分）前後保持相同的斜率，進而能保留這些分離處理部分的層析分離特徵。層析圖中梯度較平緩的部分（聚焦部分）斜率變小，可以有效地將接近目標波峰洗脫的不純物移離。

聚焦梯度是用來鎖定產物。溶劑強度會從上樣所用的低濃度，迅速增加到比產物波峰預期洗脫點低約5%。一般而言，層析圖中梯度平緩的部分會以原始分離處理斜率約五分之一進行，增加到比產物波峰的預期洗脫濃度高出約3%。梯度的平緩部分完成後，有機移動相的百分比就會迅速增加，可清洗管柱上的任何殘留污染物。由於胜肽混合物極為複雜，因此通常採用接近0.25%–0.33%變化/管柱體積的條件才能獲得最佳解析度，相較於小分子和較不複雜的胜肽採用的典型梯度斜率（五分之一的原始篩析梯度斜率）還要再平緩一點。

系統體積可用於設計聚焦梯度，以及從分析級升級到製備級的基本設定。系統體積，也稱為延遲體積或滯留體積，其定義是從梯度形成點到管柱頭部的體積，包括HPLC流路、幫浦頭、脈衝阻尼器、混合器、進樣器試樣環的所有組件和管路。按幾何比例升級時，若分析級和製備級方法的斜率保持不變，必須在梯度開始之前施加等度保持來補償系統體積。這種保持可以是小規模方法中的幾個管柱體積，或大規模方法中的部分管柱體積。初始條件下制訂的等度保持，可用於補償分析級和製備級規模之間的系統體積差異，進而確保實際梯度會在完全相同的時間開始。

使用階段式梯度（表3），其中移動相A溶劑為純溶劑，移動相B溶劑含有適當的紫外線吸收劑（即2 mL/L的丙酮），就能使用圖27和28所示的程序和算式輕鬆計算出系統體積。

表3.用於分析級和製備級系統體積測定的階段式梯度。

雖然系統體積、管柱體積和洗脫胜肽的強溶劑百分比都可以估計出來，然後根據估計值來建立分段或聚焦梯度以節省時間，不過以實驗方式來確定系統體積並記錄這些值用於後續實驗，依然是值得的。只要HPLC管路沒有任何修改，而且方法流速與量測系統體積的流速相同，那麼系統體積將保持不變。以實驗方式確定系統體積之後，就可以輕鬆計算出系統修改值（例如改變進樣器試樣環的大小），而且不需要額外測量體積。系統體積經確定完成，就可以將其用於聚焦梯度計算。

設計聚焦梯度

聚焦梯度通常是根據未純化樣品混合物的分析來設計，不過對於初始製備級運作中本來所用的梯度，修改過程是一樣的。只要使用下面顯示的算式，就可以輕鬆建立聚焦梯度。假設以下梯度是聚焦梯度的設計依據：4.6 X 100 mm 管柱，系統體積1.0 mL，管柱體積1.097 mL*
波峰滯留時間=7.76 min

*管柱體積可以使用網路上的換算程式來確定，或使用圓柱體的體積公式：V=πr2h。這些值會根據所選擇的方法略有不同，因為某些換算程式會減少液體體積以考慮管柱填料。只要所有計算都使用相同的方法，就不會對層析分離產生影響。

圖29指出使用該梯度分析的未純化合成胜肽之層析圖。
計算梯度形成點和偵測器之間的補償體積

補償體積=系統體積+管柱體積

範例：
補償體積=1.0 mL + 1.097 mL
補償體積=2.097 mL
計算溶劑到達偵測器的時間
到達偵測器的時間=補償體積(mL) / 流速(mL/min)


範例：
到達偵測器的時間=2.097 mL / 1.46 mL/min
到達偵測器的時間=1.43 min

計算形成波峰洗脫濃度的時間

形成洗脫濃度的時間=
波峰滯留時間 – 到達偵測器的時間 – 梯度保持時間

範例：
形成洗脫濃度的時間=7.76 min – 1.43 min – 0.00 min
形成洗脫濃度的時間=6.33 min

計算波峰洗脫%

%洗脫濃度=
形成洗脫濃度的時間/先導運作時長 X 先導運作變化/梯度段 + 先導運作初始梯度%/梯度段


範例：
%洗脫濃度=6.33 min / 10 min X 45% + 5%
%洗脫濃度=33.48%

注意：所有涉及百分比的計算，只會使用絕對值，亦即45 X 6.33 min，而不是0.45 X 6.33。

以每管柱體積的百分比變化計算先導運作梯度斜率

管柱體積(CV)數=
1 CV X 流速(mL) X 梯度段時間 X mL min

範例：
管柱體積數=1 CV X 1.46 mL X 10 min / 1.097 mL min
管柱體積數=13.3 CV

範例：
先導運作梯度斜率=先導運作梯度變化%
先導運作梯度斜率=45% / 13.3 CV = 3.38% / CV

以每管柱體積的百分比變化計算聚焦梯度斜率。使用先導運作梯度斜率的五分之一。

聚焦梯度斜率(%/CV)=1/5 × 先導運作梯度斜率

範例：
聚焦梯度斜率=1 X 3.38% / 5 CV
聚焦梯度斜率=0.67% / CV

從低於估計洗脫百分比5%到高於估計洗脫百分比3%–5%來建立聚焦梯度段。波峰在33.5%乙腈處洗脫。平緩梯度應從乙腈28%至36%處。計算聚焦梯度段的時間。

聚焦梯度段時間=
%變化 X 聚焦梯度斜率 X 管柱體積 X 流速(mL)

範例：
聚焦梯度段時間=
8% X 1 CV / 0.67% X 1.097 mL / 1 CV X 1 min / 1.46 mL
聚焦梯度段時間=9.0 min

寫出聚焦梯度：以先導運作初始條件開始，並迅速爬升到低於波峰洗脫濃度百分比5%。

圖30的上圖是使用聚焦梯度分析未純化胜肽的層析圖。緊密洗脫的不純物分離得更有效，但斜率降低到初始斜率約十分之一（下圖），讓不純物達到最佳解析度。這個例子清楚說明了將斜率降低到每管柱體積變化0.25%–0.33%，對複雜胜肽混合物分離處理的影響。請注意，主胜肽波峰的滯留時間依然約為7 min，與原始篩析梯度的滯留時間大致相同。因此，聚焦梯度提高了解析度，但不會延長運作時間。雖然總梯度的整體運作時間較長，但可以使用其他技術（例如提前終止運作）來加速更大規模的分離過程。這個胜肽最後按幾何比例升級平緩聚焦梯度而分離完成。

樣品引入

並沒有溶解合成胜肽的通用溶劑或技術，因為胜肽的組成和序列會直接影響溶解度。實用的溶劑選擇包括，含有0.1%–2%三氟乙酸、甲酸或乙酸的水、二甲亞碸、六氟異丙醇、6–12 M鹽酸胍、二甲基甲醯胺、0.1%氫氧化銨或10 mM碳酸氫銨。製造商有時會為溶解不同類型的胜肽提供實用指南。溶解胜肽通常會導致強溶劑中含有相對大量的樣品。

在傳統的製備級層析分離系統（圖31）中，大量進樣強樣品稀釋劑，通常讓層析圖扭曲，減少可成功分離的產物量。隨著上樣量增加，緊密洗脫的不純物也會喪失解析度。試樣環中樣品任一側或管柱頭上的水性移動相會導致樣品沉澱，降低系統的耐用性和管柱使用壽命。

在傳統分離中，於DMSO或其他強溶劑中引入管柱的樣品會立即開始沿管柱向下移動，同時攜帶樣品分子（圖32）。一直到管柱中的強溶劑經過稀釋後，樣品才會滯留。可惜當樣品譜帶滯留在管柱上時，譜帶已經相當寬了，所以會在管柱層床上相互重疊。當樣品成分從管柱中洗脫出來時，譜帶間分離不明顯，每種成分的純度都很差。

管柱內稀釋(ACD)是一種替代進樣技術，可以進樣大量的強溶劑，同時提高樣品溶解度、管柱上樣量和解析度。使用ACD時，層析分離系統的管路配置會在管柱頭處以水性移動相稀釋強溶劑中的樣品（圖33）。樣品很快就會混合並吸附在管柱上。轉移速度之快，因此不會發生沉澱現象。在樣品洗脫開始之前，強溶劑會立即從管柱中衝出。

梯度啟動後，樣品成分會洗脫成狹窄、體積小、清楚解析的譜帶（圖34）。

提高樣品成分波峰之間的解析度，可以增加樣品量，減少分離所需的進樣次數。在實踐中，使用管柱內稀釋時，管柱上樣量通常可以增加3-5倍（圖42）。由於樣品在試樣環或管柱頭的沉澱能力有限，因此使用管柱內稀釋可提高系統的耐用性。高壓停機的發生率降低，管柱使用壽命延長。

胜肽分離實作範例

製備級層析分離的原理適用於所有類型的分子，包括胜肽。以下範例說明在研究環境中分離胜肽的典型工作流程，並應用了上述方法最佳化因子。這項程序可以根據實驗室的處理要求來調整。

本例中使用的胜肽長度為17個胺基酸，含有3個鹼性殘基、2個酸性殘基、8個非極性殘基和4個極性殘基。將樣品溶解在二甲亞碸中，搭配漩渦和音振處理，然後通過0.45 µm GHP Acrodisc注射器過濾器。胜肽單同位素質量為1772.9 Da，並具有以下電荷態：
[M+H]⁺=1773.9
[M+2H]²⁺=887.5
[M+3H]³⁺=592.2
[M+4H]⁴⁺=447.2

未純化胜肽分析

在移動相中使用兩種不同的修飾劑（0.1%甲酸和0.1%三氟乙酸）對未純化胜肽樣品進行分析，以確定哪種修飾劑的分離效果更好。雖然乙腈最常當作移動相的有機成分，但在本例中使用的是異丙醇以方便說明。結果如圖35所示，相較於甲酸（C和D），TFA修飾劑（A和B）在40 °C下會產生更尖銳的產物波峰，污染物的分離效果很好。同時也在25 °C和60 °C下評估了分離效果，但實驗證明40 °C下樣品成分波峰可得出最佳峰型和解析度（圖36）。略高的溫度也會降低因異丙醇作為移動相有機成分而造成的系統背壓。

聚焦梯度

在針對未純化分析最佳化移動相修飾劑和溫度後，使用聚焦梯度來提高緊密洗脫污染物波峰的解析度。4.6 × 50 mm管柱的體積為0.698 mL，測得的系統體積為0.77 mL。用於未純化胜肽分析的HPLC方法如下所示：

計算梯度形成點和偵測器之間的補償體積

補償體積=系統體積 + 管柱體積

範例：
補償體積=0.77 mL + 0.698 mL
補償體積=1.468 mL

計算溶劑到達偵測器的時間

到達偵測器的時間=
補償體積(mL)/流速(mL/min)

範例：
到達偵測器的時間=1.468 mL / 1.46 mL/min
到達偵測器的時間=1.00 min

計算形成波峰洗脫濃度的時間

形成洗脫濃度的時間=
波峰滯留時間 – 到達偵測器的時間 – 梯度保持時間

範例：
形成洗脫濃度的時間=3.23 min – 1.00 min – 0.50 min
形成洗脫濃度的時間=1.73 min

計算波峰洗脫%

%洗脫濃度=
形成洗脫濃度的時間 / 先導運作時長 X 先導運作變化 / 梯度段 +先導運作初始梯度% / 梯度段

範例：
%洗脫濃度=1.73 min X 30% + 0% / 4.78 min
%洗脫濃度=10.85%

注意：所有涉及百分比的計算，只會使用絕對值，亦即30 × 1.73 min，而不是0.30×1.73。

以每管柱體積的百分比變化計算先導運作梯度斜率

管柱體積(CV)數=
1 CV X 流速(mL) X 梯度段時間 X mL min

範例：
管柱體積數=1 CV X 1.46 mL X 4.78 min / 0.698 mL min
管柱體積數=9.99
先導運作梯度斜率=先導運作梯度變化% / 管柱體積數


範例：
先導運作梯度斜率= 30% / 9.99 CV = 3.0% / CV

以每管柱體積的百分比變化計算聚焦梯度斜率。使用先導運作梯度斜率的五分之一。

聚焦梯度斜率(%/CV)=1/5 X 先導運作梯度斜率


範例：
聚焦梯度斜率=1 X 3.0% / 5 CV
聚焦梯度斜率=0.6% / CV


從低於估計洗脫百分比5%到高於估計洗脫百分比3%–5%來建立聚焦梯度段。波峰在10.85%乙腈處洗脫，因此，平緩梯度設計為在6.37 min內從5%–13%乙腈運作。

聚焦梯度段時間=
%變化 X 聚焦梯度斜率 X 管柱體積 X 流速(mL)

範例：
聚焦梯度段時間=8% / 0.6% X 0.698 mL / 1 CV X 1 min / 1.46 mL
聚焦梯度段時間=6.37 min


寫出聚焦梯度：以先導運作初始條件開始，並迅速爬升到低於波峰洗脫濃度百分比5%。

建立聚焦梯度後，評估了未純化胜肽樣品的分離（圖37A）。一個小型不純物波峰在產物波峰之前洗脫出來，但幾乎察覺不到。加倍上樣時（圖37B，72 µg），不純物變得更加明顯，但主峰仍然相對純淨。原始上樣量36 µg的四倍所產生的層析圖中，不純物變得更加明顯，如果將此上樣量按幾何比例升級至製備級大型管柱，那麼得出純產物的可能性多半會降低（圖37C）。分析級管柱上樣量為256 µg時，不純物與主峰完全會共同洗脫出來（圖37D）。

升級成製備級

選擇分析級管柱的72 µg上樣量，按幾何比例升級成製備級。相較於從最低注射量升級，這種保守的上樣量更有可能以更少的進樣次數得出合理量的純淨產物。上樣量與管柱體積成正比，可使用製備級管柱換算程式，或解出以下算式中的M2來確定，其中：

M1是管柱1的上樣量 M2是管柱2的上樣量
L1和d1分別是管柱1的長度和直徑 L2和d2分別是管柱2的長度和直徑

M2 = M1 X L2 / L1 X d2² / d1²
M2 = 72 μg X 100 mm / 50 mm X (19 mm)² / (4.6 mm)²

M2 = 72 μg X 36,100 / 1058
M2 = 2456 μg or 2.4 mg

將44.03 mg未純化胜肽溶解於5 mL DMSO中並過濾（濃度8.80 mg/mL）。將4.6 × 50 mm分析級管柱上的72 µg上樣量，按幾何比例升級到19 × 100製備級管柱，需要2.4 mg注射量，計算如上。未純化胜肽濃度為8.80 mg/mL，注射量計算如下：

注射量=2.4 mg X 1 mL / 8.80 mg/mL
注射量=0.272 mL or 272 μL

考慮兩種規模的系統體積（表4），將分析級聚焦梯度按比例升級成製備級。雖然製備級系統的滯留體積似乎很高，但其中有一個用於管柱加熱的5 mL預熱環和一個2 mL進樣環。考量到這些組件佔用的系統體積，因此剩餘系統管路佔用2.75 mL相當合理。按時間收集產物波峰（圖38）。

表4.梯度升級。

• 管柱：4.6 × 50 mm 管柱：19 × 100 mm
• 系統滯留體積：0.77 mL 系統滯留體積：9.75 mL
• 管柱體積：0.698 mL 管柱體積：23.804 mL
• 系統滯留體積（管柱體積）：1.10 系統滯留體積（管柱體積）：0.41 梯度補償體積：0.66

餾分分析

胜肽產物波峰會以兩個餾分來收集。這兩個餾分非常純淨，如圖39所示。在每個餾分分析和空白分析中，大約2.25 min處洗脫的寬峰很可能是移動相中低濃度的離子對三氟乙酸修飾劑所致。TFA中的疏水成分通常會在管柱上堆積，然後於梯度過程中洗脫出來。污染物並不是來自任何系統組件，例如進樣器或閥，因為另一次沒有管柱的空白分析指出，層析圖中並沒有波峰（圖40）。

管柱內稀釋

即使以高純度分離胜肽，增加每次進樣的上樣量也會提高處理效率，讓後續實驗在純化所需產物量時，能減少必要的層析分離運作次數。如前所述，管柱內稀釋簡單地更換系統管路，就能高效採用更高的進樣量（圖33）。

雖然使用管柱內稀釋法進行胜肽分離時，每個管柱體積%B的變化率，等同於幾何升級後的傳統分離方法，但是可以修改制訂的梯度表，變成包含由輔助上樣幫浦引進的有機溶劑作用（表5）。

表5.梯度比較：傳統方法和管柱內稀釋方法。

梯度時間：14.40–1.66=12.74 min 梯度時間：16.00–3.26=12.74 min
梯度體積：12.74 min × 25 mL/min = 318.5 mL 梯度體積：12.74 min × 25 mL/min = 318.5 mL
管柱體積：318.5 mL × 1 CV/23.804 mL = 13.38 CV 管柱體積：318.5 mL × 1 CV/23.804 mL = 13.38 CV
梯度斜率：8%/13.38 CV = 0.6%/CV 梯度斜率：8%/13.38 CV = 0.6%/CV
梯度期間的上樣幫浦流速=1.25 mL/min
1.25 mL/min = 總流量的5%
梯度方法總流速=25 mL/min

管柱內稀釋幫浦會將有機溶劑直接引進試樣環，並制訂為以總流速的5%運作。因此，層析分離幫浦的流速會從傳統方法的25 mL/min降至管柱內稀釋法的23.75 mL/min。請注意，總流速仍為25 mL/min (23.75 mL/min + 1.25 mL/min)。因為管柱內稀釋幫浦會直接連到進樣器，所以要在梯度開始時插入初始條件下的保持步驟，時間要足夠長，確保樣品能從試樣環完全轉移到管柱。這種系統配置的試樣環為2 mL，原始保持步驟為0.66 min。

計算管柱內稀釋方法的保持步驟：2 mL試樣環 x (1 min/1.25 mL)=1.6 min
1.60 min + 原始製備級方法的0.66 min保持步驟=管柱內稀釋方法的2.26 min保持步驟。

梯度方法的A和B百分比也經過修改，反映出管柱稀釋幫浦的作用。聚焦梯度從5%B開始，一直到13%。由於管柱內稀釋幫浦會以1.25 mL/min異丙醇這個不變流速輸送5%的總流量，因此管柱內稀釋方法中B的百分比分別制訂為0%和8% B。請注意，雖然管柱內稀釋方法的程序略有不同，但實際梯度與傳統方法相同。因為這種胜肽以如此低的B百分比洗脫，所以在管柱內稀釋方法中，5% B所花費的實際時間會更長，於是將傳統製備級方法中，從0%B變為5% B所花費的時間納入管柱稀釋法中的保持時間。為了讓讀者清楚瞭解，這兩個步驟在管柱內稀釋方法中分兩行來制訂。由於考慮到管柱內稀釋幫浦輸送的5% B而降低了B的百分比，因此必須將A的百分比增加5%，讓保持梯度與原來的傳統進樣方法相同。如果層析分離系統在進樣序列中有清洗步驟，請確保所有清洗管路都已灌注完成，並充滿強清洗溶劑。

由於按幾何比例升級的大規模分離是在40 °C下進行，因此使用管柱內稀釋方法時也要保持這個溫度。將溶劑預熱環插入水性溶劑流的T形管之前（圖41）。

然後將溶劑預熱環、T形管和管柱浸入水浴中。在開始梯度分離之前，壓力穩定了下來，代表系統已經達到平衡。雖然2.4 mg的胜肽是使用傳統管路配置所能進樣的最大量，但使用管柱內稀釋配置的系統可以將5倍的量，或12 mg (1.36 mL)引進管柱（圖42和43）。按時間收集餾分，隨後使用原始的0–30% B篩析方法進行分析。這些餾分指出純度相當高，可媲美使用傳統進樣技術的製備級分離所收集的餾分（圖44）。

疏水胜肽的特殊注意事項

將12個非極性胺基酸殘基和3個極性、不帶電荷的胺基酸殘基所組成的疏水胜肽溶解在二甲亞碸中。以下的製備級聚焦梯度用於在19 × 100 mm管柱上進行分離，而層析分離系統採用傳統進樣的管路配置。這種胜肽具有極端疏水性，因此必須使用低流速、低上樣量和60 °C的溫度。

雖然這種胜肽是使用管柱內稀釋的優選，但增加管柱上樣量會帶來沉澱的風險。由於胜肽會在約50%乙腈處洗脫，因此以5% B上樣（如上例所示）遠低於所需的洗脫強度，以至於胜肽在管柱頭稀釋時易於沉澱。在上樣步驟中增加來自層析分離幫浦的有機溶劑百分比，可以緩解潛在的沉澱問題。一般而言，對於極度疏水的化合物，在梯度方法中使用比預期化合物洗脫百分比低20%–25%的初始有機溶劑百分比，可防止樣品沉澱，同時保留管柱內稀釋技術的優勢。以下修改的管柱內稀釋梯度用於在19 × 100 mm管柱上樣5倍體積的樣品（圖45）。

梯度從48.6% B（43.6% B + 來自管柱內稀釋幫浦的5% B）開始，於29 min內以53%乙腈結束，每個管柱體積的斜率變化為0.49%，與傳統進樣所用的梯度變化率相同。管柱內稀釋幫浦會用100%乙腈將胜肽樣品從5 mL試樣環輸送到T形管，並在此與初始條件下的層析分離幫浦移動相（23.6% B，18.6% B + 來自管柱內稀釋幫浦的5% B）相遇。方法開始時會保持9.2 min，確保樣品完全上樣到管柱上。管柱內稀釋幫浦以0.8 mL/min的不變流速運作，這是16.3 mL/min總流速的5%。

所有管柱，無論是用於小分子還是大分子分離，都要偶爾清洗一次。高背壓、高層析分離背景和不能歸因於樣品的外來波峰，這種種現象均表示管柱需要清洗。

防止污染物堆積在管柱上，是延長管柱使用壽命的最佳方法。建議在進樣前先過濾所有樣品。在管柱之前加入管路過濾器或保護管柱，有助於濾出微粒和其他不需要的混合物成分。每次分離處理後，請使用兩到三個管柱體積的高百分比有機溶劑清洗管柱，這樣有助於系統化去除不需要的污染物。最後，管柱內稀釋會讓樣品保持在溶液中，防止高壓停機問題，無論其最終要抵達的是餾分收集管還是廢液罐，都能有效讓樣品成分通過純化製備系統。

突然出現的高背壓很可能是系統中某處的樣品沉澱所致，例如試樣環、管路、管柱或偵測器流體槽。開啟層析分離系統幫浦，從廢液管路開始，朝幫浦方向有條理地鬆開HPLC接頭，就能找到高壓源。背壓漸增，可能是多次進樣後管柱上的不純物堆積所致，可以有多種不同的方式進行調整。高溫下重複快速執行梯度、用高百分比的有機溶劑長時間清洗管柱，或進樣「清洗溶劑」，如DMSO或1%–10%甲酸，都可以用來去除管柱上不需要的污染物（圖46）。

去熱原，即從管柱中去除可能污染最終產物並引起過敏反應的內毒素多醣，通常需要使用1 M氫氧化鈉強烈洗滌1 h或更長時間。這個過程不可用於目前的管柱。