胜肽分離實用方法
簡介
胜肽在新候選藥物的開發中發揮著獨特作用，成為銜接傳統小分子治療藥物和大分子蛋白質治療藥物之間的特殊利基點。胜肽的功效性、安全性和在人體中的耐受性都高於小分子藥物，生產複雜性和成本又低於蛋白質型生物藥品，因此作為一種有望用於許多疾病的潛在候選藥物受到越來越多的關注。合成胜肽可用於研究細胞基質之間的結構-活性關係，或者本身也可用作有效藥物。無論胜肽是使用固相胜肽合成製程、液相合成製程逐步製備，還是從天然來源中分離，幾乎所有的原態胜肽混合物都很複雜，需要純化。就算謹慎控制合成反應，難免還是會形成雜質，還可能包含缺失、截斷或化學修飾序列，包括裂解加成物或加工過程中形成的其他副產物。
近年來，分析方法方面的技術日異月新對胜肽成為診斷技術和新興治療藥物也起到了推動作用。在先進的儀器上運作分析方法，能在更短的時間內得出更高的靈敏度和更高的解析度，這些優勢有助於在生產過程中節省大量時間。
為合成胜肽開發分離方法是一項獨特的挑戰。對於未來的研究，純度和目標胜肽產量是影響實驗結果的關鍵因素。如前所述，合成胜肽的合成、裂解和去保護過程可能會產生數量相當多的雜質。應用一般與分析級HPLC相關的方法開發原理，可以改進胜肽產物的分離效果。建立較大規模製備級純化方法的分離機制與建立較小規模方法使用的原理相同。管柱選擇、移動相修飾劑的選擇、溫度的使用和梯度最佳化都是開發任何分離方法時必須要考察的內容。透過系統地開發胜肽分離方法，可以大大提高產物的純度和產量。傳統胜肽分離通常是使用紫外線導向層析法，而使用質量導向分離搭配謹慎的方法開發流程，能夠更明確地區分目標胜肽與合成和裂解過程中形成的污染物，讓純化過程更輕鬆。
胜肽純化過程的要求
任何分離策略的目標都是盡量在更短的時間內純化更多樣品，並達到進行後續實驗所需的純度。對於要合成許多不同胜肽的典型實驗室，制定一種適用於多數樣品的標準純化實驗步驟，並且能根據需要對其進行簡單的最佳化作業，將會很有用。如果改變移動相組成、修飾劑或管柱溫度，分析作業之間的效能仍能保持一致，就無需使用多組管柱進行分離。這些提高產量和純度的方式既經濟又簡單，並且容易實行。理想的胜肽純化過程還會使用能夠執行各種分析級和製備級分離的穩固儀器。對於流速範圍較寬的通用型儀器，只要將管柱直徑改成匹配分離目標的適當大小，就能提高純化效率。綜合考慮以上這些因素可以降低胜肽純化相關的整體成本。
胜肽分離工作流程
標準胜肽分離實驗步驟（圖1）首先是明確要執行後續實驗所需的純胜肽量。原態胜肽分析可以合理估計樣品純度，結合後續研究所需的指定純胜肽量，可以估算出上樣量。上樣量會決定製備管柱的大小，進而決定所選LC儀器所需的流速。
圖1.胜肽分離工作流程。
完成原態胜肽分析之後，將方法按幾何比例升級到使用相同充填材料的較大管柱上進行分離。圖2中的升級算式指出在不同大小的管柱之間轉移分離方法時，管柱直徑、柱長、上樣量和流速之間的關係。梯度斜率以每管柱體積的百分比變化來表示，而不是每單位時間的百分比變化，如此一來可使梯度方法在從初始條件到最終條件的每個步驟中都有相同數量的管柱體積，確保解析度保持不變。製備級方法必須包括一段在開始條件下的初始保持時間，以模擬系統延遲情況，也就是小規模分離中可觀察到的現象，同樣以管柱體積數量表示。完成製備級層析分離後，對所收集到的餾分進行分析評估。隨後按照使用者準則的定義處理純胜肽。
圖2.升級算式。
液相層析系統最簡單的配置（有幫浦、進樣器、紫外線偵測器和餾分收集器）就非常適合胜肽分離（圖3）。質量偵測雖然不是胜肽分離所必需的技術，但它能鑑別胜肽目標，減少需要分離後分析的收集餾分數量。無法游離或游離效果不佳的化合物通常會使用短波長紫外線來偵測。反之，紫外線消光極低的胜肽通常很容易以MS偵測出來。
圖3.基本液相層析系統圖。
純化過程注意事項
分離模式
由於不同胜肽的性質多元紛雜，分離的層析模式也各不相同。雖然逆相層析是迄今為止最受歡迎的胜肽純化模式，但對於有些胜肽，使用離子交換或粒徑篩析等替代選擇方法來分離會更有效。這些替代技術也可以與逆相方法結合使用，為不容易分離的樣品制定兩步過程。
逆相層析
逆相層析由於再現性高、適用性廣而常被用於分離多種類型的化合物，包括胜肽。非極性的C18鍵結矽膠是最受歡迎的一種逆相管柱填料。逆相移動相通常由水和可混溶的極性有機溶劑（如乙腈或甲醇）組成，會根據化合物極性將其從C18管柱中洗脫出來。因此，胜肽的疏水性越強，就越能在C18管柱上滯留。
雖然C18是最受歡迎的逆相填料，但其他鍵結相（C4、C8、RP18、苯基等）也可以鍵結到基質顆粒上，為最佳化的化合物分離提供替代選擇性。雖然矽膠是最早用於逆相填料的基質之一，但矽膠基質填料對於分離速度、解析度、pH值、溫度和管柱上樣容量都有限制。透過專有的*雜化顆粒技術開發的全新管柱基質顆粒能在更高速度、溫度和pH值下運作，同時提高選擇性、解析度、再現性，並延長管柱使用壽命。
*美國專利號碼6,686,035 B2
離子交換層析
離子交換層析長期以來用於分離蛋白質和其他生物製劑。由於胜肽中的胺基酸可以帶正電或帶負電，因此可以用離子交換層析來分離胜肽。官能基化天然聚合物樹脂（如瓊脂糖）、合成聚合物（如聚甲基丙烯酸甲酯(MMA)或聚苯乙烯二乙烯基苯）都是大分子分離的常用介質，因為這些材料可以承受大規模生物製程的週程和批次之間必須執行的嚴格清潔要求。這些過程中使用的氫氧化鈉溶液會損壞一般用於小分子和小規模胜肽分離的矽膠基質材料。
離子交換劑共有四種類型：弱陰離子、弱陽離子、強陰離子和強陽離子。陽離子交換模式用於在負電表面上滯留和分離帶正電荷的離子，而陰離子交換模式用於在正電表面上滯留和分離帶負電荷的離子。強陰離子和強陽離子交換管柱可在較寬的pH範圍(2–12)內完全游離，而弱離子交換管柱只能在較窄的pH範圍(9.5–5.5)內游離。
使用陽離子交換模式的胜肽分離比陰離子交換模式更為常見，但首選模式實際上取決於胜肽序列。若在pH小於3的條件下分離胜肽，胺基酸側鏈羧基上的負電荷會被中和，同時N-端基團會發生質子化，讓胜肽帶正電荷而吸引到陽離子交換管柱上的負電位點（圖4）。
圖4.胜肽被陽離子交換管柱填料吸引。
反之，對於更適合在pH 6–10之間分離的胜肽，可以使用陰離子交換模式。在較高pH條件下進行陰離子交換時，胜肽上的羧基會帶負電而被吸引到陰離子交換管柱上的正電位點（圖5）。
圖5.胜肽被陰離子交換管柱填料吸引。
為使用離子交換技術進行的胜肽分離選擇管柱和開發方法時，應遵循幾條一般建議。陰離子或陽離子交換都能使用，基本原則是：酸性胜肽在陰離子交換模式下分離，鹼性胜肽在陽離子交換模式下分離。對於某些胜肽（特別是較大的胜肽），這項原則可以反過來運用，但必須調整pH值，讓胜肽的淨電荷與填充材料的電荷相反。
無論極性如何，強交換劑都是胜肽層析分離的首選。胜肽上的電荷與序列和帶電側鏈周圍微環境有關。針對特定胜肽序列，可以小幅調整移動相pH值來調整分離選擇性。這些對選擇性的小幅調整不會影響強離子交換劑的鍵結能力。
移動相和操作條件的選擇會視離子交換分離是屬於兩步純化過程的第一步還是屬於產生實驗材料的單步分離過程而定。如果離子交換所收集的材料要以逆相層析方法進一步純化，那麼緩衝液和洗脫條件就能按照蛋白質離子交換的平常做法；例如使用磷酸鹽或Tris緩衝液並以氯化鈉梯度來洗脫。產物中的鹽會在後續步驟去除。
如果選擇離子交換方法是為了一步產生可用胜肽，請謹慎挑選可以透過冷凍乾燥法去除的揮發性緩衝液。首選甲酸銨，因為它具有分別對應銨和甲酸鹽pK值的兩個緩衝區。甲酸銨可在pH 3-4條件下用於鹼性胜肽的陽離子交換層析，也可在pH 9.25-10.25條件下用於酸性胜肽的陰離子交換層析。在pH不變的情況下，可透過甲酸銨濃度逐漸增加的離子強度梯度來洗脫。或者，也可以使用pH梯度洗脫，省掉以冷凍乾燥法去除高離子強度緩衝液的耗時操作。同理，甲酸銨緩衝液是一個不錯的起點。採用陰離子交換劑分離酸性胜肽時的洗脫梯度為pH從高到低，採用陽離子交換劑分離鹼性胜肽時的洗脫梯度為pH從低到高。
粒徑篩析層析
根據分子大小進行層析分離的技術現今稱為粒徑篩析層析(SEC)，該技術可以追溯到1950年代。這種根據分子大小而不是化學性質（如電荷或極性）分離的技術，過去也稱為凝膠過濾或凝膠滲透層析(GPC)。具有規定孔隙大小分布的固定相顆粒會阻止比管柱床孔洞更大的樣品分子進入，使其迅速洗脫出來，而小分子則會進入孔隙，隨後通過更曲折和更慢的路徑洗脫。因此，大分子會先洗脫，而小分子則按照其在溶液中的大小以遞減的順序洗脫（圖6）。SEC是一種低解析度技術，使用等度方法且運作之間不需要平衡。管柱上樣量取決於樣品體積和濃度，這兩者都會影響解析度。
圖6.粒徑篩析層析樣品洗脫。
SEC有時會用做初始淨化步驟，以去除截斷序列、去保護不完全的胜肽以及其他雜質。隨著合成胜肽的序列長度增加，這些污染物的數量可能也會大幅增加。在逆相分離之前採取任何簡單的初始純化步驟都能降低層析分離的複雜性。SEC還可用於緩衝液交換，也就是將目前溶解胜肽的緩衝液更換為更適合下一個實驗或純化步驟的另一種緩衝液或溶液。
總結
許多不同的層析技術（包括逆相、離子交換和粒徑篩析）都可以用來分析和分離胜肽。半製備級分離（分離量僅有幾毫克到幾百毫克）通常採用逆相方法。本讀本後續部分將探討胜肽分離，重點介紹哪些因素和技術可以用來最佳化以逆相層析技術進行的胜肽分析和純化。
