胜肽分離實用方法

雖然傳統胜肽分離通常是使用紫外線偵測，不過質量導向分離能夠更明確地區分目標胜肽與合成和裂解過程中形成的污染物，讓純化過程更輕鬆。質量偵測可用於評估複雜層析圖中波峰的同一性和均一性，並提高樣品通量。開發一種同時包括質量偵測和紫外線偵測的分離方法能確保層析分離樣品剖析可以更完整。無法游離或游離效果不佳的化合物通常會使用短波長紫外線來偵測。反之，紫外線消光極低的胜肽通常很容易以MS偵測出來。

溶劑

胜肽分離中常用的溶劑（包括乙腈、甲醇、乙醇和異丙醇）都與電噴灑(ESI)和其他大氣壓游離技術相容。不過，乙腈在解析度、選擇性、波峰對稱性和效率方面通常都是最好的。乙腈的黏度較低，在用於層析分離時也有助於減少LC系統的背壓。溶劑的揮發性以及提供質子的能力對於ESI都很重要。揮發性有機溶劑可降低MS離子源中形成的液滴表面張力，促進更效的游離，提高靈敏度。TFA雖然能在一定程度上抑制游離作用，但不少胜肽的分析和分離都使用了酸性修飾劑（例如甲酸或三氟乙酸）。如果方法開發需要正負切換，則醋酸銨或甲酸銨移動相是可接受且適用於MS的選擇。為了在高pH條件下更有效地分離胜肽，使用碳酸氫銨製成的移動相就比較合適。為了降低在質量偵測器中沉澱的可能性，揮發性緩衝液應使用20 mM以下的濃度。

管理偵測

製備級層析分離中的偵測必須要特別考慮。高度密集的波峰會超出大多數偵測器的線性範圍，高流速與偵測器硬體不相容。MS和ELSD等偵測器都具有破壞性。因此需要有效降低到達偵測器的流量和濃度，同時盡量減少樣品損失。樣品在到達偵測器之前通常使用被動分流器進行分流和稀釋（圖47和48）。補充溶劑能稀釋製備流採樣，並將其轉移到偵測器。

被動分流器可以搭配特定的層析分離流速範圍和分流比使用。分流器流體必須與所選管柱適合的流速相符。當波峰以較高濃度洗脫時，使用的分流比也較高。常用的分流器及其分流比見表6。

表6.Waters被動分流器。

主動分流器是被動分流的替代方案，會以與所設定的分流比相稱的速率對製備流進行機械採樣。採樣流隨後由補充溶劑稀釋並攜帶到偵測器。不過，主動分流器經常會干擾基線，此外，它的機械磨損也常會導致效能損失。被動和主動分流器在對製備流進行採樣時同樣有效，因此所採用的分流器類型取決於使用者偏好。

修飾劑

根據胜肽分離後的預期用途選擇特定的移動相和修飾劑。如前所述，移動相修飾劑是一種添加劑，可藉由提高或降低移動相pH來控制胜肽的離子特性。還能與胜肽的帶電側鏈和末端形成離子對，從而提高樣品的疏水性。三氟乙酸的用途通常就是如此。

離子對會增加胜肽與疏水管柱固定相的交互作用，並因此提高分離品質。可惜的是，胜肽與TFA形成的強離子對無法在電噴灑游離條件下輕易分解，導致游離的胜肽分子數量減少，訊號強度降低。理想情況下，最合適的修飾劑應該是又能夠形成離子對改善層析分離，但又不妨礙電噴灑游離。

Apffel等人提出以管柱後添加弱酸的方法與TFA競爭和分析物配對。濃度夠高的弱酸可促進競爭向有益於TFA質子化的方向進行，經過質子化的TFA可以蒸發，讓分析物更有效地游離。這有助於增加MS訊號的靈敏度和強度。許多不同濃度的酸都可用於此用途，例如，在質量導向純化中，使用含有0.1%丙酸的1:1水/有機溶劑溶液作為補充溶劑成功達到上述效果。

單同位素質量與平均質量

雖然質量導向純化可以降低胜肽目標分離的不確定性，但還是要考慮哪些質量應該用於餾分觸發。對於多數小分子分離作業，單同位素質量是用來鑑定的主要質量，而其他相關離子加成物則是根據此值來定義和監測。對於胜肽等大分子，有時會使用平均質量作為主要鑑定參數。

單同位素質量是使用分子中每種元素豐度最高的同位素質量來計算，而平均質量則是使用分子中每種元素所有自然存在的同位素之加權平均值來計算。因此，胜肽的平均質量明顯大於其單同位素質量。隨著分子中碳原子數增加，就越有可能存在更多13_C，分子量又會再增加。

此外，單同位素質量可能不是質譜圖中豐度最高的波峰。雖然沒有規定何時該使用單同位素質量或平均質量，但是分子量範圍1500–1700通常是銜接到使用平均質量觸發胜肽收集的交叉點。在實踐中，許多適用軟體程式都會同時計算胜肽電荷態的平均和單同位素m/z。最謹慎的做法是將這兩種替代方案都納入作為觸發條件，在分離之前的篩選期間就能很容易確定最佳的觸發選擇。

電荷態

電噴灑是一種在溫和條件下游離樣品並產生多電荷分子的技術，經常用於質量導向純化。雖然某些胜肽的分子量可能高出分析器的質量上限，但是m/z值較低的多電荷離子通常會落在質譜儀的質量範圍內。數種因素都會影響胜肽的電荷態，包括溶液pH、酸性和鹼性官能基的數量，以及分析所用溶劑的物理性質。

如前所述，胜肽分離過程通常是從分析開始。計算分子量和可能的電荷態，確保能更容易鑑定胜肽產品。原態樣品剖析不僅指出了需要何種程度的方法開發才能讓解析度提高到能夠分離純產物，還指出有關電荷態的資訊。請看圖49中原態胜肽分析級分析的總離子流層析圖得出的質譜圖，計算的胜肽質量為1772.9，存在帶正電荷的離子(1773.9)，只是數量非常少。目前為止，887.8處的二價電荷離子是豐度最高的離子。圖中還存在少量三電荷離子(592.3)和雜質(781.2)。雖然質譜圖中存在多電荷離子，但是胜肽在層析圖中卻顯示為單峰。此時可以預測，在提取離子層析圖中，二價電荷和三電荷波峰會同時洗脫出來（圖50）。

餾分收集觸發器

胜肽的多電荷特性通常使其難以預測指定MS實驗中豐度最高的離子。因此，使用質量導向純化來進行胜肽分離時，餾分觸發器必須包括所有預期的多電荷離子。

數據收集：連續模式與質心模式

由於胜肽樣品錯綜複雜，可能含有多電荷態，並且隨著胜肽序列長度增加要替換使用單同位素或平均質量等方案，因此MS數據應以連續模式來收集。連續數據可指出質量軸上所有解析點的觀察強度，包括量測特定強度之m/z時，統計的不精確性。接著可以處理該原始訊號，產生每個可能重疊質量訊號的強度，這樣就能鄰近的相似m/z。質心數據是經過處理的連續數據，可顯示質譜圖中每個離子分布的單一集中數據點，並在質譜圖中顯示為棒狀圖（圖51）。

質量導向胜肽分離範例

使用所探討的原理，以質量導向純化分離以下兩種胜肽（由Research Genetics, Inc.的KellyWasmund博士提供，公司地址為美國阿拉巴馬州亨茨維爾）：

• NH2-ISQAVHAAHAEINEAGR-COOH（縮寫為ISQA）
• NH2-SIINFEKL-COOH（縮寫為SIIN）

每種胜肽用0.5 mL二甲基甲醯胺(DMF)分別潤濕，然後用水稀釋至5.0 mL。ISQA的濃度估計為5–10 mg/mL，SIIN估計為10 mg/mL。每種胜肽的小規模分離條件見表7；層析分離和質譜結果分別如圖52和53所示。ISQA和SIIN各電荷態目標離子的計算結果如表8所示。

小規模
溶劑A：0.1% TFA水溶液
溶劑B：0.1% TFA的乙腈溶液
注射量：40 µL
管柱：4.6 × 50 mm Symmetry 300, C_18, 5 µm

大規模
溶劑A：0.1% TFA水溶液

溶劑B：0.1% TFA的乙腈溶液
注射量：5 mL
管柱：30 × 150 mm Symmetry 300, C_18, 7 µm
目標質量：(ISQA) [M+H]⁺ = 1773.9、[M+2H]²⁺ = 887.5、[M+3H]³⁺ = 592.2、[M+4H]⁴⁺ = 447.2
目標質量：(SIIN) [M+H]⁺ = 963.5、[M+2H]²⁺ = 482.3、[M+3H]³⁺ = 321.9

表7.ISQA和SIIN小規模分離使用的梯度條件。

表8.ISQA和SIIN各電荷態目標離子的計算結果

瞭解凡第姆特(van Deemter)曲線

分別為每種胜肽制定了聚焦梯度，旨在提高目標胜肽與其鄰近洗脫污染物之間的解析度。ISQA製備級分離的聚焦梯度從12% B開始增加到20% B，胜肽在17% B附近洗脫（表9和圖54）。同理，SIIN製備級分離的聚焦梯度範圍為23%–31%B，產物在28% B附近洗脫（表10和圖55）。用於餾分收集的質量觸發器包括預期的多電荷離子（表8）。

瞭解凡第姆特(van Deemter)曲線

表9.ISQA純化採用的製備級聚焦梯度。

表10.SIIN純化採用的製備級聚焦梯度。

製備級運作所產生的餾分經過分析後可評估出純度。使用多個偵測通道來監測分析，對餾分提供完整的表徵分析。ISQA和SIIN胜肽的餾分分析採用的梯度方法與原態胜肽分析相同。ISQA和SIIN的結果分別如圖56和57所示。

總結

隨著合成、藥物設計、藥物研究和開發與製造技術不斷更新和改進，胜肽正在逐步成為治療領域的重要利基。不論科技如何日新月異，胜肽分離的基本原理依然保持不變，許多過程還是仰賴逆相HPLC搭配紫外和質量偵測功能。使用快速梯度來分析原態胜肽，設置聚焦梯度並將分離方法升級到具有管柱內稀釋和溫度控制功能的更大管柱上，是快速分離目標胜肽的有效方法。雖然胜肽分離廣泛採用紫外線偵測，但質量導向純化可以減少所收集的餾分數量，從而縮短後續餾分分析所需的時間。使用分流和稀釋技術來管理偵測器訊號，使用合適的層析移動相、修飾劑和補充溶劑，並為餾分觸發選擇合理的電荷態，都能簡化胜肽純化實驗步驟。