製備級超臨界流體層析(SFC)初學者指南

分析級方法注意事項

當要升級一種分析級方法以進行純化製備時，務必確保該應用已獲得最佳的層析分離效果。分析規模的解析度越高，代表製備規模的層析分離效果越好，能實現更高的通量並提高餾分純度。分析級方法還必須考慮製備技術的條件，如管柱加熱、進樣模式、壓力降、系統壓力和相符的管柱。如果以MS進行純化，那麼分析規模的所有篩選和方法開發也應使用MS偵測來完成。若是梯度方法，梯度斜率和平衡時間需要考慮分析級系統和製備級系統之間的體積差異。稀釋劑的影響也需要考慮在內，因為分析級上樣經常是使用混合流進樣來完成，而製備級方法則是使用修飾劑流來進樣。

上樣

考慮到進樣策略的差異，上樣研究一開始通常以較小的（分析級）規模進行。在樣品引入系統之前，一定要先瞭解化合物在樣品中的溶解度。製備級應用中的最佳實踐是以最少量的溶劑上樣最多的樣品（高濃度樣品）。此外，樣品在引入CO₂與有機溶劑的混合移動相後也必須保持溶解狀態。確定可接受的濃度之後就會進行上樣研究，逐漸增加注射量直到解析度損失，或者層析分離不再能夠得出目標化合物的純餾分。

成功升級的一般要求

開發出可接受的方法並在分析規模完成上樣研究之後，在升級時最好讓滯留性和選擇性保持不變（或相似）。為了成功升級層析方法，有幾個參數需要保持不變：

■ 移動相必須相同；在SFC中，這代表共溶劑（溶劑B）相同，而且CO₂的品質、進樣端壓力、物理狀態（液態或氣態）和輸送方法要相似。

■ 管柱的充填材料、長度和粒徑大小要相同，以便不同規模的層析分離結果相符。如果在分析規模使用了小粒徑管柱，則管柱之間的長度與粒徑比(L/dp)必須相同。

■ 樣品濃度要相同，並用相同的稀釋劑溶解。

幾何升級

Prep SFC與LC一樣，注射量（上樣量）和流速按幾何比例調整。

為保持峰型和載樣量，需要根據管柱尺寸適當調整注射量。載樣量由以下方程式確定：

其中Vol是注射量(µL)，D是管柱內徑(mm)，L是管柱長度(mm)。

同樣，為了維持分離處理的品質，流速會根據管柱尺寸調整。對於相同長度和粒徑大小的管柱，流速的幾何升級方法如下：

其中F是流速(mL/min)，D是管柱的內徑(mm)。

滯留體積與管柱外體積

當管柱長度相同時，需要根據滯留體積來變更製備級方法中的梯度曲線。若要進行這些調整，必須量測分析級系統和製備級系統的滯留體積。測定滯留體積的常用方法是，將能夠出現紫外線訊號的化合物或溶劑添加到共溶劑中，並在沒有管柱的情況下執行梯度。根據幫浦的梯度開始與偵測器訊號變化之間的時間延遲，將時間延遲乘以流速即可測定滯留體積（圖25）。

另外，請務必注意，任何管柱外體積的影響，例如管路、進樣閥、試樣環大小、偵測器流體槽和分流器，都可能會導致最終層析分離中出現譜帶擴展的現象。為了量測管柱外體積和譜帶擴展情形，請移除管柱後進樣。進樣與偵測之間的時間乘以流速等於管柱外體積。沒有管柱時的峰型代表因管柱外體積而導致的任何擴展現象。因為系統管路是為採用修飾劑流進樣而設計，所以進樣100%的共溶劑，以便更準確地測定體積，不必在進樣後添加CO₂。有關此程序的詳細訊息，請見「製備級OBD管柱計算器」，這是一個線上應用程式，取得網址為www.waters.com。管柱計算器是一個簡單好用的工具，可協助從分析級升級到製備級的所有計算。

移動相密度注意事項

LC的簡易升級規則雖然適用於SFC，但不能直接應用，因為LC假設移動相的密度不變。SFC中的升級更為複雜，主要是因為移動相的可壓縮性會導致整個管柱和系統之間的密度、壓力和溫度有所變化。這些因素的變化會影響移動相的組成和強度。由此對滯留性和選擇性造成的影響使得在分析規模和製備規模的系統之間保持分離曲線變得更加困難。

密度和溫度的變化無法直接控制，但可在SFC中調整以下方法參數，使層析分離成功在多個規模間相符：

■ 符合系統之間的平均壓力（以及平均密度）。平均壓力等於前後壓力總和除以二。變更分析級或製備級儀器上的自動壓力調節器設定，即可讓壓力相符，保持管柱內的相似壓力（密度）分佈。但要注意的是，平均壓力相符不一定能確保密度分佈相符，只是會讓分佈顯示出更好的一致性。

■ 二氧化碳和共溶劑的移動相組成精確相符。這基本上是從體積流到質量流（分析級）或質量流到體積流（製備級）的系統之間的單位轉換，以便讓兩者的移動相等效。

在SFC中，共溶劑組成是控制波峰滯留最重要的參數。因此，準確調整共溶劑組成是升級方法的關鍵。透過保持CO₂和共溶劑的質量流與組成以及管柱出口壓力和溫度相符，不論是體積流型儀器，還是質量流型儀器，都能放心升級。

升級範例

在本例中，分析級方法是在UPC²系統上開發，參數如下（表6）。

為了保持管柱長度和粒徑大小不變，製備級系統使用21 x 150 mm Chiralpak IA管柱，粒徑為5 µm。注射量按幾何比例調整，因此4.6 mm內徑管柱上的進樣量10 µL，相當於在21 mm內徑管柱上進樣208 µL。在此例中，分析級系統上的CO₂幫浦由體積流控制，而製備級系統上的幫浦則是由質量流控制。因此，在計算升級的幾何比例之前，必須將分析方法的CO₂流速轉換為質量流。使用以下方程式完成。

■ CO₂ 流量 = 2.67 mL/min

■ CO₂ 密度 = 0.89 g/mL

■ CO₂流量（質量）= CO₂流量 x CO₂密度

■CO₂流量（質量）= 0.89 x 2.67 = 2.38 g/min

由於共溶劑通常會按比例升級（mL至mL），且共溶劑流速為0.33 mL/min，因此在甲醇大約12%時，總分析流速為2.70 g/min。這個流速和百分比是按幾何比例調整，因此21 x 150mm管柱在12%共溶劑條件下的製備級流速為56 g/min。

測定出流量和組成之後，密度分佈就必須與使用相同平均壓力的分析級系統相符。分析級系統的前壓為162 bar，後壓為120 bar（壓力降為42 bar），因此計算得出的平均壓力為141 bar。由於製備級系統的壓力降僅為24 bar，因此必須將背壓設為130 bar，以符合分析級系統的平均壓力。最後，溫度也必須相符，保持在35 °C。使用這些參數可成功讓分離方法從ACQUITY UPC²系統升級到Prep SFC系統，如圖26所示。曲線雖然相同，但是在製備級系統上滯留性略有增加，可能是由於進樣策略不同所致。分析級系統使用混合流進樣，而製備級系統則是使用修飾劑流進樣。

堆疊進樣

許多應用都會使用堆疊進樣。堆疊進樣可縮短進樣週期之間的時間，進一步節省溶劑用量。堆疊進樣還會運用所有可用的層析分離空間進行連續分離和純化，大大提高通量。通常會在已經注入的樣品仍在管柱上（或正從管柱上洗脫）時進樣。因此，要運用堆疊進樣，需要使用等度方法。為了成功執行堆疊進樣，需要確定正確的循環時間（或進樣之間的時間）。此外，需要為序列中最後一次進樣確定總運作時間，以確保洗脫和收集到所有波峰組。圖27顯示了這些值的測定方式以及將其應用於一組堆疊進樣的情況。由於循環時間約為總運作時間的一半，因此在第一個目標波峰開始洗脫之前，要進樣兩次。在最後一次進樣後洗脫並收集到兩組波峰。在此例中，相較於傳統的單次進樣，使用堆疊進樣可讓總處理時間縮短一半。

應用範例

由於上述SFC的選擇性範圍擴大，因此這項技術適用於各種應用（表7）。

表7.按市場領域劃分的製備級SFC應用

無論純化的市場領域或目標如何，製備級SFC都會提供：

■ 一個簡單好用的平台，包辦多元選擇性

■ 層析分離升級範圍

■ 更高的生產力，節省溶劑

■ 與逆相LC的正交性

■ 結構相似化合物的分離和純化

本節以應用範例摘錄來展示不同的工作流程和應用領域。以上所有應用都能到Waters網站www.waters.com上完整查詢。

利用SFC對揮發性香精香料進行掌性純化

SFC的主要應用領域之一是掌性分離。如同掌性藥物的鏡像異構物會表現出不同的藥理活性一樣，香精香料化合物的立體化學決定了味道、氣味品質和強度。由於這些化合物有揮發性，因此純化這些化合物可能會非常困難。SFC為掌性香精香料化合物的高回收率提供了一種快速、低溫的選擇。

在此例中，使用掌性製備級SFC和堆疊進樣，分別從薰衣草和茶樹精油中純化出芳樟醇和萜品烯-4-醇的鏡像異構物。圖28顯示了將分析級方法從4.6 x 250 mm AD-H管柱升級到半製備級10 x 250 mm AD-H管柱的情形。茶樹油分離結果顯示有兩種萜品烯-4-醇鏡像異構物，而薰衣草油僅含有一種芳樟醇鏡像異構物。製備級SFC方法參數顯示在表8中。

這些方法為等度，因此使用堆疊進樣，最大限度提高收集效率。從層析分離結果可知，茶樹油的循環時間約為3分鐘，薰衣草油的循環時間為2分鐘。使用堆疊進樣得到的掌性純化結果如圖29所示，其中50 mg茶樹油在40分鐘內處理完畢，30 mg薰衣草油在30分鐘內處理完畢。

餾分分析見圖30，所有三個餾分的純度均大於92%。使用萜品烯-4-醇和芳樟醇的外消旋標準品進行回收率研究，得到70-80%的回收率，有鑑於一般報告的回收率相當低，這種結果值得注意。

使用以MS進行的餾分觸發對藥物化合物進行非掌性純化

使用紫外線導向的純化，偵測器無法區分出彼此的波峰。許多化合物都會吸收相同的波長。質量導向純化會根據質量來收集餾分，這是一個更具體的參數，因為可以區分出目標物和任何不純物。在合成活性藥物成分時，有時最終產物中會有中間不純物。

伊馬替尼是一種酪氨酸激酶抑製劑，用於治療多種癌症。在本例中，反應中間體和最終產物經過純化，用於合成伊馬替尼。第一步是使用三支非掌性管柱和甲醇（含或不含氫氧化銨添加劑）來篩選混合物。篩選結果如圖31所示。BEH 2-EP管柱和含氫氧化銨的甲醇被選為最佳化和升級的最佳方法參數。

為了最佳化升級方法的分離效果，為中間體和產物分別開發了聚焦梯度。根據篩選梯度的斜率和每個相關波峰的滯留時間，計算洗脫時的共溶劑濃度。中間體在共溶劑為14%時洗脫，而產物則在共溶劑為29%時洗脫。以這些百分比為中心開發出2分鐘的聚焦梯度；以低5%開始，以高5%結束。

升級時請使用相同的管柱充填材料，而且長度與粒徑比(L/dp)保持不變。1.7 µm顆粒(L/dp=29.4)的3 x 50 mm分析級管柱升級到5 µm顆粒(L/dp=30)的19 x 150 mm製備級管柱。升級後的層析方法（聚焦）和質量導向收集顯示在圖32中。