SFC純化奠基於超臨界流體技術(SFx)。Waters SFx技術包括萃取(SFE)、分析級層析(UPC²)和製備級層析(Prep SFC)；這些技術都使用次臨界或超臨界CO₂作為主要溶劑。SFx技術以CO₂代替液態有機溶劑和水性溶劑，為液體型純化技術提供了一種正交替代方案，並且更環保、更具成本效益。SFx因為能省去有機溶劑廢液，減少環境足跡，所以被視為「環保」技術。相較於LC純化，這項技術在速度和選擇性上都有所提升，也就是說，從複雜的起始原料到終產物所需的時間和成本都大大降低。隨著近期儀器技術有所進步，現在不少純化應用中都能充分發揮SFx技術的分離能力。

許多物質需要極端條件才能達到超臨界狀態，而且會在該狀態下表現出不良特性。表1列出了幾種物質轉變為超臨界流體的條件及其在這種狀態的特性。CO₂與其他超臨界物質不同，因為不易燃、不易爆、無毒，也沒有腐蝕性，所以一般被視為安全物質。由於CO₂很容易達到超臨界狀態（31 °C和74 bar），因此能在可接受的溫度和壓力範圍內控制密度。此外，由於其臨界溫度相對溫和，因此適用於熱不穩定的樣品。CO₂也相對便宜，因為很容易從其他工業製程中回收；也就是說，它對環境CO₂濃度的影響是中性的。這些優點讓CO₂成為超臨界流體技術中最常用的物質。

純化工作流程包含多個步驟，其複雜性和必要性取決於具體應用要求。基本上，SFx純化工作流程包含以下部分。

起始原料或樣品：樣品可能很複雜（如天然的植物樣品），也可能相對簡單（如表徵分析得當的候選藥物），這會決定需要多少樣品前處理（如果有的話），以及純化的規模。要盡量多瞭解樣品和最終產物的特性，例如熱穩定性、極性、溶解度和反應性，就能知道如何處理樣品。

樣品前處理：在純化過程的第一步，需要根據起始原料的狀態和應用目標或範圍來適當製備樣品。樣品前處理的步驟很多，例如研磨、乾燥、萃取和過濾，也可以直接將樣品溶解在溶液中。超臨界流體萃取(SFE)是SFx工作流程的第一步（樣品前處理），通常用於原始工業產品、生技植物藥或天然物的相關應用。

樣品純化：純化的目的是降低樣品複雜性，或將最終產物分離到一定純度規格內，以便進行分析或產品配方。SFE製備的樣品通常是含有目標化合物和不純物的複雜混合物。SFx工作流程的第二步是製備級超臨界流體層析(Prep SFC)（純化），這個步驟會從萃取物中純化一或多個目標物。Prep SFC也可以應用於以許多不同方法製備的樣品，而不僅僅是SFE製備的樣品。

終產物：終產物是工作流程的最終目標。它可以是分析產生的數據和資訊、製程中使用的精煉材料，或者是能直接使用的最終產物。終產物決定了工作流程要成功所需的儀器和方法。在SFx工作流程中，使用極致效能合相層析(UPC²)來分析萃取(SFE)和純化(Prep SFC)前後的樣品。

這些SFx技術都可以視需要在非SFx工作流程中用作製備、純化或分析步驟。

20多年來，製備級高效能液相層析(Prep HPLC)一直是最常用的純化技術之一。具體來說，這項技術是精緻化學品、製藥和生物技術產業相當熱門的一種分離製程，廣泛用於產品的純化作業。這段時間以來，Prep HPLC已發展成相當有效和適用的技術，特別是對於非掌性純化。逆相液相層析(RPLC)的優點是使用近乎通用的固定相(C₁₈)和普遍適用的水和乙腈混合移動相。RPLC可用於質譜儀(MS)，RPLC搭配MS (RPLC-MS)已成為許多研究環境中的標準純化方法。

Prep HPLC雖然很受歡迎，但有幾個缺點。相較於所處理的總樣品量，純化指定質量的化合物所需的移動相體積很大。典型的Prep HPLC餾分含有大量溶劑（有機溶劑和水性溶劑），由於乾燥和採集最終產物需要花費大量時間和精力，讓分析效率無法提升，形成瓶頸。

LC所使用的溶劑會污染環境，包括局部污染（透過蒸發和接觸），以及燃燒化學廢物的大規模污染。正相液相層析(NPLC)對環境的危害更大，因為移動相通常由100%的有機溶劑組成。由於這些環境因素，LC所用溶劑的採購和處置成本日益上漲，讓更多無溶劑或更環保的製程更有吸引力。SFC是一種替代技術，能幫助減緩瓶頸，促進營運調整，進而縮短時間、減少溶劑廢液並降低成本。近期，SFC儀器有了新的進展，再度引起人們的關注，把該技術當成掌性和非掌性純化的有力工具。在分析和純化方面，SFC是比HPLC「更環保」的替代方案。

超臨界流體層析(SFC)是一種層析技術，使用次臨界（液體）和超臨界CO₂作為移動相的主要溶劑，通常還搭配有機溶劑。SFC與所有層析技術一樣，根據分析物在固定相（管柱）和移動相（溶劑）之間的分配情況來分離成分。HPLC和SFC有許多相似之處，例如：SFC可以使用等度和梯度方法條件來運作，而且可與所有標準偵測技術相容，例如紫外線(UV)、光電二極體陣列(PDA)、揮發光散射(ELS)和質譜(MS)。一般Prep SFC工作流程與HPLC相同，包括方法開發、升級、餾分收集，以及收集餾分的純度分析（圖3）。SFC在回收率和純度方面也與RPLC相當，在某些應用上SFC的回收率更高，而在其他應用上HPLC則是更好的解決方案。

SFC通常使用的是正相層析的原理。SFC與HPLC的不同之處在於，SFC使用CO₂替代非極性液體成分（例如己烷和庚烷）作為移動相的主要成分。由於超臨界CO₂是一種可壓縮流體，因此壓力和溫度成為可以控制溶劑強度、影響滯留性和選擇性的重要參數。超臨界CO₂不易燃、無毒、擴散率高、黏度低、溶劑化力強，因此有益於層析純化。近年來，SFC因能大大節省溶劑、提高分析效率，對純化製備實驗室相當有吸引力。

Prep SFC的一大優點就是，使用CO₂替代大部分移動相，節省溶劑使用量。在分析規模，這項優點也許不太明顯，但在製備規模，效果就會非常顯著。許多純化製備實驗室都要去除所收集餾分中的溶劑，過程相當耗時，以致於在純化製備化合物和得出所需目標產物或結果之間，形成瓶頸。在Prep SFC中，移動相的CO₂部分可在洩壓時去除，只留下少量共溶劑。所產生的餾分就有更高的產物濃度，縮短溶劑去除和產物分離所需的時間。也可以直接分析餾分，無需樣品富集或濃縮步驟。對於在一般長時間乾燥條件下快速分解的化合物來說，這點尤其重要。

SFC的有機溶劑用量少還帶來了其他優點，例如節省成本、更安全（在可燃性和毒性方面），以及對環境的影響更小。在溶劑的採購和處置方面也有相當大的成本優勢；不僅如此，由於去除溶劑所需的能源消耗量較低，因此也能進一步節省成本。另外，SFC還可避免使用有毒溶劑，例如RPLC中使用的乙腈，以及NPLC中使用的脂肪烴和含氯溶劑。CO₂作為溶劑相對便宜，因為是來自其他工業製程的副產品，而且可以回收再利用。

Prep SFC的優點：提高效率

在SFC中，由於移動相黏度低、擴散率高，所以分析效率更好，讓層析分離的速度和效率也隨之提高。圖4比較了HPLC、UPLC、SFC和UPC²的范第姆特(van Deemter)曲線。層析分離的速度部分取決於溶質在移動相中擴散的速度，以及進出固定相的速度。SFC的范第姆特曲線比HPLC更寬、更平坦，代表隨著流速（線性速度）增加，SFC的層析分離效率依然很高（平板高度值低）。在SFC中，擴散係數較高，可直接轉化為更快速的層析分離。

由於移動相的黏度較低，管柱和系統壓力也較低，因此線性速度可以達到HPLC的3-4倍，還能使用較小粒徑的管柱。黏度低還可以縮短平衡時間。效果是運作時間更短、分離效率更高，讓載樣量增加且進樣週期加快；這些在任何製備級層析分離過程中都算得上是提高分析效率的關鍵參數。因此，能在更短的時間內產生純化合物，進而提高整體分析效率。HPLC和SFC之間節省時間和提升效率的範例參見表2。

SFC和RPLC之間的正交關係讓許多應用更有機會提高產物品質。RPLC使用C₁₈管柱作為近乎通用的解決方案，雖能大大簡化方法開發作業，但水性移動相會限制溶劑相容性與化合物溶解度的範圍。另一方面，SFC適用於多種有機稀釋劑，所以溶劑和化合物的相容性很大。可供選擇的固定相種類也相當多。

之所以說SFC是RPLC的正交技術，是因為SFC通常會視為正相層析技術，並且可以提供多種簡單好用的層析分離選項。SFC既有正相選擇性，分離效率也高，特別有益於分離立體異構物、位置異構物和結構相似化合物。若是非極性化合物，SFC則可靈活使用逆相管柱（如C₁₈），同時加水作為添加劑，將應用範圍擴展到極性更強的區域。在化合物容易降解的應用中，SFC純化是最為理想的替代方案，因為這種方法分離速度快、無需使用水，還能在低溫下快速完成餾分乾燥。

Prep SFC的回收率和純度可媲美RPLC，而且兩者在許多應用上都能重疊。圖5顯示了以SFC和LC進行純化，篩選化合物藥物庫的研究結果。大約82%的化合物能以其中任一種技術純化。不過，研究也同時指出這兩種平台的互補情形。某些化合物只能以SFC純化(4%)，而其他化合物只能以LC純化(8%)。兩種平台搭配使用帶來的靈活性就有很大的機會能發揮分離處理和純化製備的最佳效果。SFC的選擇性與RPLC互補，面對棘手的複雜樣品，可讓方法開發和分離處理採取正交方法。不分平台進行多步純化，或使用正交技術進行餾分分析，可以回收純度更高的產物並得出更多資訊。圖6顯示了使用正交LC和SFC分離從複雜基質中純化製備化合物的範例。