製備級超臨界流體層析(SFC)初學者指南

管柱篩選

在以層析方法來分離目標化合物之前，需要先進行方法開發。通常先開發分析級方法，以節省溶劑、縮短時間並節省樣品。在SFC中，混合物單一成分在規定固定相上的滯留性是無法預測的。不同於RPLC，SFC分離一定要確定正確的管柱充填材料，這是SFC方法開發中最重要的因素。因此，務必要使用有效的篩選策略，盡可能提高純化目標的分離品質。目前，固定相的開發相當活躍，少數鍵結相可能會成為未來的首選管柱充填材料。現今，多數使用者會使用「最」適合相關應用的管柱來因應自動化篩選過程。

為了確定一組適合篩選的管柱，需要考慮幾個因素。分析級管柱和最終的製備級管柱之間需要保持L/dp（長度/粒徑）一致，因此只有大小適當的分析級管柱才會列入考慮。這樣一來就能確保層析方法在系統間升級時的連續性。管柱的選擇性應廣泛，還要適合樣品的性質。例如，強極性化合物（如碳水化合物）不太可能滯留在C₁₈管柱上，而矽膠管柱可能不適合極度疏水（非極性）的化合物（如多數類胡蘿蔔素）。管柱也可以根據它對鹼性或酸性化合物或兩者的適用性分類。

若是掌性純化，就需要掌性管柱。由於固定相與目標化合物的交互作用更為複雜，因此需要多次反覆試驗，才能確定最適合用於掌性分離的管柱。不過，某些管柱的命中率高於其他管柱。例如，纖維素和直鏈澱粉衍生的掌性固定相因適用性廣泛而受到歡迎，而其他掌性固定相（如Pirkle型固定相）則因化學穩定性高而廣受歡迎。掌性固定相也可成功用於非掌性應用，尤其是位置異構物或密切相關的化合物。

管柱篩選一般會使用梯度溶劑條件來完成，共溶劑比例通常介於2%–50%之間。這些條件能讓使用者明白哪種管柱最適合分離目標化合物，同時也能知道化合物洗脫所需的共溶劑百分比。圖14顯示了(R)和(S)-goitrin（一種在菘藍根中發現的活性天然物）分離的掌性管柱篩選範例，使用五種纖維素和直鏈澱粉基固定相（IC、OJ-H、AS-H、OD-H和AD-H）以及一種Pirkle型固定相(S,S)-Whelk-O1¹⁶。圖15顯示了非掌性管柱篩選範例，使用三種類胡蘿蔔素的混合物對四種非掌性固定相進行了篩選¹⁷。可以看出，類胡蘿蔔素在C₁₈上的滯留性最好，在其他極性更強的固定相上滯留性較差。

溶劑篩選

光是使用CO₂通常不足以讓化合物從層析分離管柱中洗脫出來；因此，一般會添加極性共溶劑。共溶劑選擇是SFC層析分離方法開發和最佳化的關鍵參數。大多數應用都可以使用多種共溶劑和混合物來發揮最佳分離效果。SFC中可用溶劑的範圍似乎很廣，不過可以透過配對極性譜圖的兩端簡化選擇範圍；非極性CO₂搭配強極性有機溶劑可以形成涵蓋大範圍溶劑強度的移動相。

四種最常用的共溶劑是甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈；甲醇極性最強，乙腈極性最弱。一般情況下，建議使用甲醇或乙醇進行管柱篩選和初始溶劑篩選。異丙醇和乙腈適合用於方法的最佳化，或者在乙醇或甲醇無法產生可接受的解析度時使用。很多時候，搭配使用這些溶劑就能微調移動相的極性。例如，將乙腈加到乙醇中能削弱共溶劑的強度，增加滯留性並提供不同的選擇性。隨著共溶劑強度降低，滯留性通常會增加。此外，與LC如出一轍，隨著強溶劑比例增加，滯留性會降低（圖16）。不過，由於CO₂的黏度較低，有時可以透過提高總流速（在相同的共溶劑百分比下）縮短運作時間而不影響分離效果（圖17）。

共溶劑中的添加劑

波峰更尖銳、解析度更高，對製備級層析來說非常重要，因為波峰變寬和溶解度差會導致分析效率很差。在移動相的共溶劑部分使用添加劑可以抑制SFC的峰拖尾現象，這會擴大CO₂移動相的適用溶質範圍。

使用CO₂作為層析分離溶劑並搭配其他極性有機溶劑使用時，移動相呈微酸性。由於CO₂移動相呈微酸性，因此許多酸性和中性化合物不必使用移動相添加劑就能表現出可接受的峰型。不過，酸性添加劑還是可以改善某些酸性化合物的峰型（圖18）。常見的酸性添加劑包括三氟乙酸、甲酸和乙酸。含有鹼性化合物的應用通常需要使用鹼性添加劑（用量一般在0.1%和1%之間）來改善層析分離（圖19）。常見的鹼性添加劑是二級胺或三級胺，例如異丙胺(IPA)、二乙胺(DEA)或三乙胺(TEA)。這些添加劑即使濃度非常低（共溶劑中低至0.01%）也非常有效，只是會干擾MS偵測，而且可能對某些管柱充填材料（特別是未鍵結矽膠）產生記憶效應。因此也會使用醋酸銨和氫氧化銨，它們對管柱和MS更加友善，甚至能增強MS訊號。

除了經典共溶劑外，許多新型管柱也可用於非經典共溶劑或添加劑，包括乙酸乙酯、四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿或二甲氧基甲烷。這些組合可以進一步調節滯留時間和選擇性，同時提高樣品溶解度。水就是一種越來越流行的非經典添加劑。水雖然與CO₂不混溶，但在強極性共溶劑（如甲醇）中當成添加劑使用時，能增加親水化合物在SFC中的溶解度並改善峰型，變成絕佳的選擇。耐受水量取決於共溶劑在總移動相中的比例。最後，由於移動相中的相分離（不混溶），可觀察到基線雜訊。通常，在極性共溶劑中可以有效使用1%–5%的水。以水為添加劑時，Prep SFC能純化極性更強的化合物。

純化時最好不要使用下游步驟得去除的添加劑。如果分離時需要使用添加劑，請使用容易去除的揮發性添加劑，並以最低有效濃度添加。此外，現在已經出現了不再需要那麼多添加劑新型固定相，這對Prep SFC明顯有利。

所有化合物的溶解度和滯留因子都與流體密度息息相關。

管柱的移動相密度非常重要，因為移動相的物理和化學性質都操之在此。SFC有個巧妙的特性是，能使用溫度和壓力來控制移動相的密度。雖然管柱和移動相的選擇對SFC的分離效果最有影響力，但溫度和壓力也可用來對分離方法進行微調或最佳化。在這兩個參數中，壓力對層析分離的影響更大；隨著壓力增加，移動相密度也會增加，這通常會導致滯留時間縮短，解析度降低（圖20）。另一方面，溫度升高會讓移動相密度變小，滯留時間延長。不過，溫度的影響還是要取決於化合物本身，並且有可能會改變解析度，甚至改變相鄰洗脫化合物的洗脫順序；這在掌性分離更為常見（圖21）。

使用背壓調節器(BPR)在管柱後設定系統「背壓」可控制壓力。雖然系統設計的壓力範圍很廣（高達400 bar設定點），但在Prep SF中，背壓調節器通常會設定在100–200 bar (1450–2901 psi)之間。使用烘箱（加熱管柱）或熱交換器（加熱移動相）可按設定點來控制溫度。

溫度設定點一般在40 °C–60 °C之間。而某些在次臨界（液態CO₂）條件下運作的應用，溫度會設定在25 °C–35 °C之間，同時保持相對較高的壓力。不建議在接近臨界點的壓力和溫度下運作，因為此時的溫度或壓力只要稍微有點變化，就會導致密度（和層析分離）變化很大。溫度和壓力限制通常都與管柱充填材料或充填方式的穩定性有關。

最佳化移動相條件

最佳組合的溶劑和管柱選擇通常因特定的應用或目標而異。在理想情況下，上樣量高、解析度良好、分離處理快速，就能完全回收高純度的目標化合物。可在現實中，通常需要妥協才能確定分析效率最高的解決方案。例如，要讓波峰妥善分離（以較高的上樣量），就需要更長的運作時間。另一方面，波峰妥善分離且運作時間明顯縮短能讓循環時間更快，但上樣量就會變低。另外要注意的是下游製程或餾分回收，此時溶劑數量或類型是一個重要因素。最後，如果能在等度條件下完成分離，就能使用堆疊進樣，大大提高分析效率。選好管柱和溶劑之後就可以調整其他參數，以在升級和純化之前發揮更好的分離效果。

最佳化梯度條件：在SFC中，聚焦梯度的運作方式與RPLC不同。由於正相層析中有許多相互競爭的滯留機制，因此梯度變化會對不同分析物的滯留性產生不同的影響。具體而言，在SFC中，隨著共溶劑在梯度上增加，密度和壓力降也會發生變化。當共溶劑量增加時，對滯留時間的影響並不是呈線性，因此很難預測化合物隨條件變化的選擇性。至於結構相似化合物，因為是遵循相似的滯留機制，所以問題不大。樣品中含有不同結構的化合物混合物（例如，在基質中）時會更棘手。不過，使用更平緩的梯度一般會讓滯留時間延長，解析度提高。

確定等度條件：等度方法因為易於根據篩選結果來開發，而且可以使用堆疊進樣來提高分析效率，所以是最理想的方法。使用滯留時間、篩選梯度的斜率，並補償系統和管柱延遲體積，就能確定洗脫時的共溶劑百分比。在SFC中，最佳化的最佳起點通常是低於所計算百分比5%。

篩選梯度為5分鐘內2%–20%，梯度延遲為0.46分鐘（預先測定）。因此，在計算斜率為3.6%/min，起始百分比為2%的情況下，使用以下方程式來計算4.12分鐘處第一個波峰洗脫時的共溶劑百分比：

■ 洗脫時的共溶劑百分比 = (滯留時間 – 梯度延遲) x 梯度斜率 + 起始百分比

■ 洗脫時的共溶劑百分比 = (4.12 min–0.46 min) x 3.6%/min + 2%

■ 洗脫時的共溶劑百分比 = 15%

因此，減去5%之後，等度條件下10%的共溶劑可作為最佳化的起點。從所得出的層析分離結果可以看出，波峰分離妥當；而將移動相的共溶劑比例重新提高到15%後，波峰解析度依然不錯，而且運作時間更短。在這種情況下，10%的方法可以提高上樣量，而15%的方法可以加快循環時間。

系統規模

對於Prep SFC，儀器可以在2 mL/min至數百mL/min的流速下運作，滿足在各種規模下運作所需的要求。在適當的工作流程中，純化規模需要與應用目標相符。當樣品有限或溶解度較低時，這點就尤其重要。在這種情況下，小規模（半製備級）純化系統更為實用。在SFC中，小規模純化通常使用內徑4.6 mm–10 mm的管柱，流速為3–20 mL/min。下表為Prep SFC中管柱大小與流速和大致載樣量的比對表（表5）。需要注意的是，特定樣品的載樣量取決於許多因素，包括溶解度、目標化合物的解析度以及在基質中的相對含量。

更大規模的Prep SFC系統會使用18–50 mm內徑的管柱，流速為50–350 mL/min。管柱容量變大，每次進樣的上樣量就更多，流速也更高，進而最大限度提高這些應用的通量。在包羅萬象的純化領域，這些系統只能算做中等規模。已經有許多既定的工業製程使用大型試驗規模的Prep SFC系統（本書未提及）。這些製程會使用非常大（內徑30 cm或以上）的高壓動態軸向壓縮(DAC)層析管柱，並通常作為工廠設施來運作。

工作流程：「大量」或「分批」

根據具體應用，Prep SFC會使用兩個基本工作流程。第一種稱為「大量」純化。在此工作流程中，單一樣品會大量多次進樣，直到回收完所需數量的目標化合物或樣品耗盡為止。所有相符的收集餾分都會匯聚到一個個收集瓶中，但瓶數有所限制。然後用幾個小時（有時甚至數天）處理和回收「大量」材料。一般而言，這是紫外線導向的純化，不過也可以使用其他偵測方法。這種工作流程通常用於樣品表徵分析得當、獲得充分了解而且目標是提高分析效率的情況。

許多「大量」應用都會使用堆疊進樣。堆疊進樣會運用所有可用的層析分離空間進行連續分離和純化，大大提高通量。基本上，堆疊進樣可縮短進樣週期之間的時間，進一步節省溶劑用量。堆疊進樣的範例見圖22。在某些應用中，可在第一組波峰洗脫之前多次進樣。若要使用堆疊進樣，系統必須要能在收集的同時進樣。因此，可使用單獨的進樣模組或能夠自主移動收集和進樣組件（針和探針）的系統。

「分批」純化是指對庫純化最實用的工作流程，或者在需要純化多個樣品中的多個目標時使用的工作流程。一般使用質量導向純化，因為可在收集餾分時更具選擇性。使用光學（或紫外線）導向的純化，偵測器無法區分出彼此的波峰。許多化合物都會吸收相同的波長。質量導向純化會根據質量來收集餾分，這是一個更具體的參數，因為可以區分出目標物和任何不純物。當樣品含有複雜基質、表徵分析不夠好，或由於沒有發色團而無法用紫外線偵測時，這種方式尤其有用。通常採用梯度方法來改善峰型，讓化合物與複雜干擾物更好地分離。這個工作流程會使用開放層床收集方式，將餾分收集到多支試管中，通常每支試管只有一種餾分。樣品「分批」運作，並根據其質量來收集目標化合物。「分批」純化也可以僅由紫外線觸發，或由紫外線和MS共同觸發。圖23顯示了以MS方式從天然物中純化目標化合物的範例。