製備級超臨界流體層析(SFC)初學者指南

流路和硬體

現代的製備級SFC儀器相當進步，許多與製備級SFC相關的障礙都已經克服。圖7指出Prep SFC儀器的一般流路。SFC的基本流路與HPLC相同，包括二元幫浦和方法控制裝置、使用進樣器將樣品引入流路、採用管柱進行分離處理、波峰偵測和餾分收集。SFC還需要額外的技術，主要用於處理CO₂的可壓縮性和膨脹性。這些裝置包括熱交換器(HE)、背壓調節器(BPR)、氣液分離器(GLS)，以及幾乎普遍使用的高壓不銹鋼配管。

各元件的注意事項

幫浦：SFC與LC一樣，使用二元幫浦系統來輸送「A」溶劑（此例中一律為CO₂）和「B」溶劑（通常是極性有機溶劑，如甲醇）。視系統規模而定，CO₂會以兩種方式來輸送，一種是按體積（體積流，分析級規模的典型方式），另一種是按質量（質量流，製備級規模的常用方式）。由於CO₂可以壓縮，但因為密度不同，所以相同體積下的質量不一定相同。只要流速可以再現，不受環境條件影響，則任何一種輸送方法都會有用。大多數情況下，CO₂會在幫浦之前或幫浦頭內部冷卻，然後以液體形式輸送，減少移動相密度出現任何差異。此外，所有密封件、逆止閥、管路和接頭都要能處理高壓的可壓縮流體，不會洩漏。因為CO₂很容易透過任何開口而膨脹，所以即使小小的洩漏，也會對系統效能和層析分離造成很大影響。CO₂的幫浦輸送效果不佳，無論是因為管路洩漏、密封件或逆止閥所致，都會導致滯留時間和選擇性發生變化，不僅如此，還會造成壓力（密度）控制不佳，出現基線雜訊。

進樣：有兩種常用的進樣模式：混合流和修飾劑流，〈SFC進樣策略〉一節將會有詳細的探討。混合流SFC進樣方案會採取洩壓步驟，用來在上樣之前排出試樣環中的所有CO₂。在同時設有混合流和修飾劑流進樣模式的系統中，洩壓操作有時也會用來當作安全預防措施。洩壓操作一般透過輔助「排氣」閥來完成。這種設置有個缺點就是，進樣過程中會增加系統的管柱外體積，導致波峰擴展，解析度損失。使用小內徑管路盡可能減少管柱外體積就能減少波峰擴展。

管柱烘箱和加熱：在SFC中，由於壓力和溫度會影響移動相密度，所以是決定分離效果的方法參數。因此，移動相和管柱必須要經過適當加熱並進行溫度控制。如果溫度控制不當，管柱中出現的溫度梯度會對峰型和解析度產生不利影響。在許多SFC系統中，溫度控制是指在烘箱中加熱管柱或預熱移動相，或兩者一起。

確定正確的管柱充填材料（掌性和非掌性）對SFC至關重要。因此，SFC應用需要進行管柱篩選。許多SFC系統配備的烘箱內都會隨附某種切換閥，以便在多支管柱之間進行選擇。在純化許多不同的樣品和目標物時，可能會需要不同的管柱充填材料，切換閥對這類應用尤為重要。

偵測器：純化製備中使用的所有典型偵測技術（例如紫外線/可見光、PDA、MS和ELS）都能與SFC相容，還能在單一系統中使用多台偵測器。通常，紫外線/可見光偵測器和PDA偵測器因為是非破壞性偵測器，所以會接在主流路中，用於初級偵測。這些偵測器的流體槽需針對SFC中所使用的壓力確定適當的額定值。破壞性偵測器（例如MS和ELS）則使用分流器技術來連接，這項技術可以相對控制分流比，並調節溶劑以最佳化偵測訊號。系統可以記錄或使用多台偵測器的訊號（或通道）來觸發餾分收集，擴大了這項技術在分析級和製備級SFC中的應用範圍。這些偵測器在SFC中的運用將在本章〈SFC中的光學偵測和MS偵測〉一節更詳細地介紹。

背壓調節器(BPR)：控制移動相沿管柱的密度是SFC儀器設計中最重要的因素之一，因為所有化合物的溶解度和滯留因子都與流體密度息息相關。密度控制主要以控制系統內的壓力來完成。背壓調節器是一種自動化裝置，用來將系統的管柱後壓力（背壓）控制在方法指定的壓力下。為了獲得合適、可再現的層析分離，即使在梯度條件下和不同運作之間，管柱後壓力也必須保持不變（保持在設定點）。 

雖然CO₂ 在74 bar（約1073 psi）和31 °C以上就達到超臨界狀態，但通常不建議在接近臨界點的條件下運作，因為該區域的溫度或壓力只要稍微有點變化，就會導致密度變化很大。因此，就滯留性和解析度來講，在該區域開發的方法，穩固性較差。此外，使用共溶劑時，在低壓條件下更有可能發生相分離現象，進而出現基線雜訊。因此，多數SFC方法都會設定較高的壓力點，通常在100 bar (1450 psi)以上。

收集觸發器：在Prep SFC中，可以使用閾值、時間和斜率收集模式（定義見表3），在多個通道和偵測器上觸發收集行為。布林邏輯可用來展開更有智慧的收集，也就是在收集之前要滿足多個條件。收集條件可以包括模式的組合（如閾值和時間），或偵測器訊號的組合（如紫外線閾值和質量確認）。

表3.製備級SFC中所用收集模式的定義。

收集時間延遲也很重要，必須在偵測器和收集系統之間確定適當的延遲時間，才能讓目標化合物獲得最佳回收率。與Prep HPLC一樣，延遲時間取決於流速。不過在SFC中，收集時間也會隨移動相成分和壓力的變化而變化。使用補充溶劑和能夠減輕CO₂膨脹現象的其他技術，我們可以在設定的流速下更有效地控制各種條件下的收集時機。

SFC的進樣策略

目前，SFC應用中有兩種進樣方法：混合流進樣和修飾劑流進樣。在混合流進樣中，整個移動相（CO₂和共溶劑）會捲掃試樣環，將樣品帶到管柱上。混合流進樣的常見問題是，強稀釋劑效應會引起波峰畸變和滯留時間偏移。標準做法是將樣品溶解在極性修飾劑（共溶劑）中。使用甲醇等強溶劑會導致一些分析物無法被固定相吸收，導致波峰流穿或畸變。滯留性較差的波峰受到的影響會更大，峰型畸變更嚴重。隨著注射量增加，極性溶劑團塊會在移動相中引起局部干擾，使波峰進一步扭曲，解析度也會降低。這種進樣策略還需要洩壓，但會對上樣量和再現性產生影響。經證實，使用混合流進樣時，極性與CO₂相似的稀釋劑（如己烷、庚烷或其他非極性溶劑）可以改善峰型（圖8）。

第二種進樣策略是修飾劑流進樣，這種方法會先將樣品注入移動相的有機部分（共溶劑），再與CO₂混合，類似於LC純化所用的管柱內稀釋方案。這種方法的思路是，在不影響移動相整體強度的情況下引入樣品，並在整個進樣和運作過程中保持預定的溶劑百分比，來減輕稀釋劑的影響。在這種方法中，稀釋劑應與用於分離處理的共溶劑匹配；不過也可使用其他稀釋劑。修飾劑流進樣可以改善峰型並提高解析度，因此能提高注射量和上樣量（圖9）。

在共溶劑百分比較低的情況下使用修飾劑流進樣時，由於共溶劑幫浦的流速低，所以將樣品施加到管柱頭的時間會增加。由於移動相的擴散性高，相較於混合流進樣，進樣時間延長可能會導致波峰變得更寬。不過，比起共溶劑百分比較低的大體積混合流進樣，峰型還是有所改善。即使混合流可將樣品加速轉移到管柱，但在這些條件下造成的干擾已經遠超過它帶來的好處。隨著共溶劑百分比增加，進樣技術的選擇已經沒那麼重要，但在共溶劑百分比較低的情況下，修飾劑流進樣明顯是更好的策略。

PDA偵測和紫外線/可見光偵測

SFC中的光學偵測有一些特定的注意事項。移動相密度的變化以及CO₂和共溶劑之間折射率的差異，會在紫外線/可見光偵測器和PDA偵測器中產生基線漂移和雜訊。這些影響在梯度條件下會特別明顯。在PDA偵測器中，可以使用單波長通道和波長補償來調整基線，以降低基線雜訊，提高靈敏度（圖10）。在紫外線/可見光偵測器中，設定單波長可讓基線雜訊和漂移不那麼明顯。

從硬體的角度來看，特定的流體槽設計可用來應對SFC應用中的高壓，也適用於Waters 2998 PDA和2489紫外線/可見光偵測器。流體槽設計屬性，包括路徑長度、幾何形狀和流體槽材料，都經過一番研究，能在SFC應用中發揮出最佳的偵測效果。

MS偵測

SFC的一大優點是兼具正相選擇性與MS相容性。SFC中採用的CO₂不僅替代了己烷和庚烷等不能用於質譜儀的溶劑，而且能透過氣體膨脹協助MS離子源內的霧化和顆粒形成。SFC可用於各種MS儀器中的ESI、APCI和雙模式採集作業。Waters ACQUITY QDa偵測器因為簡單好用，所以在Prep SFC中特別有用。然而，在共溶劑百分比較低的情況下，往往沒有足夠的離子來達到最佳偵測訊號。因此，一般會在分流處加入調節溶劑（或補充溶劑）來增強MS中的訊號。典型的調節溶劑為甲醇、水和添加劑（通常是氫氧化銨或甲酸）的混合物。視使用者的偏好、MS儀器類型和應用規模而定，可使用其他許多調節溶劑混合物，並設定各種不同的流速。Waters ACQUITY QDa偵測器使用和不使用調節溶劑的MS-ESI偵測範例見圖11。

ELS偵測

SFC也可用於ELS偵測。與MS如出一轍，ELS偵測也需要分流並添加補充溶劑來改善訊號。由於SFC移動相非常容易揮發，因此需要額外的溶劑來捲掃樣品，才能在ELS偵測器中得出更好的訊號。SFC的ELS偵測在操作上的控制類似於LC。

Prep SFC中的收集作業：CO₂膨脹注意事項

在考慮Prep SFC中的收集控制時，一定要留意移動相會膨脹的特性。純CO₂從臨界點（31 °C和74 bar）轉變成大氣壓條件（1 bar和15 °C）時，體積膨脹約250倍。

在製備級SFC系統中，高壓CO₂會在背壓調節器(BPR)處排出。隨著排出CO₂的壓力增加，體積膨脹倍數會呈指數增長。在二元系統中（例如典型的SFC移動相），隨著CO₂餾分降低，有機部分增加，膨脹會有所消減。膨脹發生時，移動相的溶解能力也會隨之降低，這是因為溶劑化力不足以及焦耳-湯姆遜冷卻現象導致的。冷卻還會導致形成乾冰，進而阻塞管路。缺乏膨脹控制會導致收集流路中的波峰變形，降低餾分純度。還可能使目標化合物被掃入廢液，或者在收集點因蒸發而損失，造成回收率下降。

為了成功收集餾分，SFC儀器中會使用許多策略來控制CO₂膨脹的問題及其影響。首先，為了緩減冷卻現象和相關問題，儀器會在背壓調節器之後的初始膨脹點處對移動相進行加熱。其次，在許多情況下都會添加有機補充溶劑，不僅能讓化合物保持在溶液中，還可以降低CO₂的體積餾分，幫助控制膨脹。更有效地控制膨脹能夠改善BPR後的峰型並提高回收率。最後，CO₂會被排出或去除。為了做到這點，一般會使用某種相分離裝置，例如高壓旋風分離器或氣液分離器(GLS)（圖12）。

高壓旋風分離器會將移動相的較重（液體）部分推往旋風分離器的外部和底部，同時讓CO₂氣體從中心和頂部逸出。高壓旋風分離器的優點是不需要補充溶劑（即使在共溶劑百分比較低的情況下），因為可透過收集閥來保持CO₂的溶劑化力，並在旋風分離器中進行相分離。不過也有幾個缺點。高壓收集系統需要耐高壓材料，例如不銹鋼，而且由於回收餾分會連帶出現噴霧和膨脹現象，因此安全風險增加。這些系統還會限制使用者只能使用數量有限的「封閉式層床」收集位置。氣液分離器(GLS)是一種低壓替代選項，優點多多。低壓系統可以使用額定壓力較低的材料，安全風險大大降低。雖然收集作業通常需要額外的溶劑，但在低壓條件下，CO₂更能完全去除，使開放層床收集成為現實，大大增加可收集的餾分數量，提升這項技術的適用性。

廣泛的選擇性和適用性

製備級SFC能大大提高純化過程的選擇性。SFC通常使用正相分離，不過這項技術也可以靈活使用傳統的RPLC管柱和溶劑，擴大化合物的相容性範圍。選擇性廣泛是SFC的一個明顯優勢，因為能在單一平台內提供正交分離，簡化整個純化過程。

SFC相容性：溶解度

SFC基本是以正相層析分離模式運作。在典型運作條件下，大部分移動相是非極性CO₂，搭配少量極性有機溶劑，分離使用小顆粒填充管柱，其中含有相對極性且官能基種類多的固定相。由於移動相黏度低，管柱顆粒小，所以SFC主要用於小分子應用。不過，越來越多更高分子量的應用也開始使用SFC來完成。換句話說，某化合物能否使用SFC主要是取決於溶解度。SFC的溶解度範圍非常廣。事實上，以一般規則而言，任何可以溶解在有機溶劑中的樣品都適用於SFC。這點非常實用，因為許多樣品前處理技術都會讓樣品溶解在有機溶劑中，所以就能直接進樣到Prep SFC儀器中。

化合物在有機溶劑中的溶解度與分配係數（通常是指LogP）有關，這點也很實用。一般而言，LogP是化合物親脂性或疏水性的量度。具體來說，LogP是指化合物在兩種不混溶的混合溶劑（通常是水和正辛醇）中於兩相之間溶解達到平衡時的濃度比。因為CO₂是一種非極性溶劑，所以LogP值能清楚指出化合物在SFC條件下的行為方式。化合物的LogP值低表示極性較強，在CO₂中的溶解度較差，對極性管柱充填材料的親和力更高；而LogP值高表示極性較弱，在CO₂中的溶解度更好，對管柱的親和力較低。這些特性在RPLC中正好相反，在RPLC中，移動相是極性，固定相則是非極性。

在分析級(UPC²)應用中，上樣量較低和濃度較低的樣品可用於分析LogP值介於-2和9之間的化合物。不過在製備級SFC中，在上樣量高的條件下，將化合物引入CO₂時一定要保持在溶液中。樣品若含有製備級濃度和含量的強極性或親水性化合物，在進樣到系統之前應測試溶解度。一般的測試方法是，將樣品溶解在合適的有機溶劑中，然後引入少量己烷或庚烷。如果樣品從溶液中沉澱出來，通常會認為不適用於製備級SFC。

Prep SFC有個缺點是，強極性化合物的溶解度差。不過，在移動相的有機部分添加少量水（作為添加劑，一般低於5% v:v）就能使SFC的樣品極性範圍更廣泛。水能提升親水性化合物的溶解度，讓這些化合物得以分離和純化。因此，SFC的適用範圍可以擴展到胜肽、蛋白質、核鹼基和其他親水性分析物的研究。雖然已有研究證實這項技術有助於極性應用，但在製備級SFC中應謹慎使用，避免樣品沉澱或系統出口處結冰。

SFC適用性：共溶劑

共溶劑選擇是SFC層析分離方法開發和最佳化的關鍵參數。在正相和逆相液相層析中，溶劑混溶性都存在限制。正相中的脂肪烴和逆相中的水都會限制分離過程所用溶劑的極性範圍。在SFC中，超臨界CO₂可與逆相和正相有機溶劑（從甲醇到庚烷）混溶，在開發分離方法時有了更廣泛的溶劑選擇性。選擇性廣泛可大大增加SFC相容應用的範圍。

SFC適用性：管柱

逆相層析分離多數是在數量有限的固定相上進行，通常是C₁₈或類似的疏水性管柱。涵蓋逆相（非極性）和正相（極性）範圍的多種掌性和非掌性管柱充填材料都適用於SFC。大多數管柱都能有效洗脫出鹼性、中性和酸性化合物，表示Prep SFC適用於具有各種化學官能基的管柱。使用多種管柱雖然會被視為缺點，但同時也讓特定化合物的純化有機會發揮出最佳選擇性。現代Prep SFC固定相更能多多使用SFC來進行掌性和非掌性純化。特別是Waters Viridis和Torus管柱專為SFC應用而設計，這些產品穩定性更高、選擇性廣泛並且峰型更好，還能減少添加劑的使用需求。表4列出了Prep SFC適用的Waters管柱。管柱選擇是方法開發和最佳化的關鍵參數。

掌性分離

目前為止，SFC仍是分離掌性化合物的最佳層析解決方案，比起其他層析技術（如正相HPLC），它的分離效率和速度明顯更高。掌性分離通常會使用正相HPLC。SFC可大幅縮短分離時間，同時提高解析度並減少溶劑消耗量。

因此，在SFC環境中會大量使用掌性管柱，不僅用於掌性應用，還用於分離非鏡像異構物、代謝物、位置異構物和其他結構相關化合物。雖然纖維素和直鏈澱粉基固定相最常用，但其他掌性固定相也適用。SFC在純化這些化合物上有幾項優勢，例如餾分純度更高、效率更高，以及溶劑用量減少而節省了更多成本。圖13顯示了使用正相HPLC和SFC對氯菊酯鏡像異構物和非鏡像異構物進行掌性分離的情形。

使用HPLC未能解析所有四個波峰，但使用SFC在更短的時間內解析出這些波峰，並且使用的管柱更短。