合相層析初學者指南

本章先回顧CC所用的術語，接著說明適合以ACQUITY UPC²系統分析的樣品與分析物類型。我們詳列了共溶劑、移動相添加劑和樣品稀釋劑的作用，壓力和溫度對密度的影響，以及這類作用如何影響分離。最後介紹方法開發的通用流程。

術語

如前所述，CC與RPLC很相似，不過是以壓縮CO₂取代水作為弱溶劑（移動相A）。溶劑、共溶劑或修飾劑這類傳統術語都是指移動相B（強洗脫溶劑）的主要液體成分。一般而言，CC所用的共溶劑是甲醇，但也可以使用其他有機溶劑，例如乙醇、異丙醇、乙腈或這些溶劑的組合。添加劑是添加到共溶劑中的低濃度鹽或液體，作用是改善峰型和/或分析物溶解度。添加劑也會影響層析分離選擇性。常見添加劑包括二乙胺、氫氧化銨、甲酸、三氟乙酸、甲酸銨、醋酸銨或少量水。濃度適當與否取決於添加劑；例如，如果其他方法條件選擇不當，水的添加量高於5%就有可能會形成雙相移動相。

討論任何新的分析方法時，首先要問的是「我的樣品能用這項技術（合相層析）分析嗎？」最簡單的答案是：能溶於有機溶劑的樣品都可以使用CC技術進行分析。這個問題沒有標準答案，還需進行一些實驗才能證實。相容於有機進樣溶劑是非常實用的特性，因為許多樣品前處理技術是在有機溶劑中產生樣品（例如液/液萃取、固相萃取、蛋白質沉澱）。CC的優點是，能將溶於有機溶劑中的樣品直接進樣到ACQUITY UPC²系統中，不必像RPLC一樣必須經過費工耗時的蒸發和回溶步驟。第5章會深入探討這個主題。對分析科學家而言，盡可能多瞭解樣品總是好的（圖23）；瞭解越多，開發穩固方法的機會就越大。化合物在各種有機溶劑中的溶解度與分配係數（通常稱為log₁₀ P）有關，這點也很實用。分配係數(P)是指化合物在兩種不混溶的混合溶劑（通常是水和正辛醇）中於兩相之間溶解達到平衡時的濃度比（圖24）。該係數是衡量化合物在這兩種溶劑之間溶解度差異的指標。分配係數可以衡量化合物的親水或疏水程度。

以CC來說，分配係數有助於確定目標化合物是否適合以ACQUITY UPC²系統進行分析。根據經驗，log P值介於2到9之間的化合物都適合使用CC進行分析。

合相層析中的共溶劑

共溶劑有兩個作用。第一，共溶劑會影響CO₂的溶劑化力。第二，共溶劑會影響分析物與固定相之間的交互作用。改變共溶劑（例如甲醇換成乙腈）會影響滯留性和選擇性。共溶劑在CC中的作用類似於強溶劑在逆相LC中的作用；單純CO₂的洗脫強度大致接近庚烷的洗脫強度。

第1章表1列出了多種有機溶劑的洗脫序（洗脫強度），並強調CC最常用的四種共溶劑：乙腈、異丙醇、乙醇和甲醇。表中所列溶劑全都能與CO₂混溶，因此滯留性和洗脫強度相當廣泛。

將共溶劑添加於CO₂移動相中，通常會縮短分析物的滯留時間。共溶劑的濃度增加會改變移動相的極性，因此縮短滯留時間。圖25說明了在等度分離中改變共溶劑濃度對滯留性所造成的影響。隨著強洗脫共溶劑（甲醇）的濃度降低，分析物的滯留性會增加。這種現象與在RPLC中看到的一樣。

圖26說明移動相強度隨不同共溶劑而改變的情形。甲醇是最強的共溶劑，洗脫分析物的速度最快。異丙醇的強度低於甲醇，但高於乙腈，而乙腈則是CC所用三種共溶劑當中最弱的，分析物滯留時間也最長。其他層析分離模式中也會發生類似的層析分離行為；溶劑越強，滯留時間越短，洗脫分析物的速度越快。

CC可以混合不同的共溶劑，從而改變溶劑強度及造成不同的滯留性。圖27說明在美多普胺及相關不純物的梯度分離中，向甲醇中添加較弱的共溶劑（乙腈）所造成的影響。隨著乙腈濃度增加，甲醇濃度及溶劑強度隨之降低，滯留時間會變長。以不同的共溶劑進行這項分離時，選擇性略有不同、解析度變好，峰型也更尖銳。

合相層析中的添加劑

與RPLC一樣，CC也使用添加劑來改善峰型和/或分離的解析度。圖27中的四張層析圖顯示了向所有共溶劑混合物添加甲酸銨所造成的影響。添加劑可以修飾固定相表面，也可以用作離子對來改變選擇性。鹼性添加劑較容易改善鹼性化合物的峰型，並且可能會稍微改變選擇性。鹼性添加劑的範例包括氫氧化銨、2-丙胺和三乙胺。酸性添加劑能改善酸性化合物的峰型，並且可能會改變選擇性。常見的酸性添加劑包括三氟乙酸、甲酸和乙酸。圖28顯示酸性分析物的分離結果，在此範例中，增加酸性添加劑的濃度能改善峰型。

改用不同的添加劑可能會大幅影響峰型和滯留性（圖29）。在分析這些鹼性分析物（β阻斷劑）時，若使用不含添加劑的甲醇共溶劑，會導致峰型不佳。添加甲酸反而會讓峰型更糟。甲酸在220 nm的偵測波長處也能吸收，導致基線傾斜。對於這些強鹼性化合物，添加醋酸銨(20 mM)能大幅改善峰型，添加二乙胺也是如此，這是因為使用鹼性添加劑往往能改善鹼性化合物的峰型。

合相層析中的樣品稀釋劑

雖然CC能與多種樣品稀釋劑相容，但要獲得最佳峰型，有時仍需選擇合適的稀釋劑。在CC中，樣品稀釋劑強度會大幅影響峰型和溶解度。與其他層析分離模式一樣，我們建議使用較弱的樣品稀釋劑（越弱越好），以利在分析物溶解度和峰型之間取得平衡。在CC中，這表示應使用接近洗脫序最前端的有機溶劑來溶解樣品（表1）。Waters建議使用庚烷/異丙醇(90:10)，這是很好的通用溶劑，能在溶解度（異丙醇）和峰型（庚烷）之間取得平衡。應盡可能減少或去除樣品所含的水分。圖30所示為中性化合物對羥苯甲酸丁酯訊號峰的七張疊加層析圖。隨著注射量增加，進樣溶劑強度對峰型的影響也會開始浮現。使用強洗脫共溶劑甲醇時，隨著注射量增加，開始出現前沿峰現象。使用較弱的異丙醇時，前沿峰現象比使用甲醇時少，峰型也稍高。而使用建議的樣品稀釋劑異丙醇/庚烷時，所有注射量下的峰型都更尖銳、更對稱。

壓力、溫度和密度

自動化背壓調節器(ABPR)設定會改變壓縮CO₂的密度，因而影響滯留時間。ABPR壓力設定增加，密度隨之增加，滯留時間則會縮短。雖然移動相組成對分離的影響最大，但調節壓力和移動相密度也能微調方法。圖31說明，在其他所有參數一律保持不變時，增加ABPR設定（壓力）會縮短滯留時間。

 與RPLC一樣，在CC中，管柱溫度會影響選擇性和滯留性，對不同分析物的影響程度也不一樣。升高管柱溫度會增加分析物分子的能量，就像在LC和GC一樣，應該會導致分析物分子在固定相上的滯留時間縮短。不過在CC中，在恆壓下升高溫度也會降低移動相密度，因此會減弱其溶劑化力，從而延長滯留時間。因此，在CC中改變溫度會造成雙向作用。通常情況下，隨著管柱溫度上升，移動相密度會下降，滯留時間會延長（圖32）。另外還注意到，在50 °C時出現了額外的（小型）訊號峰。之所以會出現這個訊號峰，原因在於溫度對不同分析物的影響不同，因此選擇性也會略有不同。

瞭解共溶劑、添加劑、樣品稀釋劑、壓力、溫度和固定相的作用後，就能透過改變這些參數控制峰型、滯留性和選擇性。表5匯總了本章的全部內容，說明如何運用這些工具讓CC分離發揮最大效用。但請注意，每種參數之於特定分離的重要程度未必相同。舉例來說，控制選擇性時，固定相所發揮的作用有時比選擇共溶劑更大。在其他情況下，將甲醇換成50:50甲醇/乙腈所發揮的作用則比改變管柱充填材料還要大。

通用方法開發流程 - 方法1

圖33所列的流程說明如何快速判斷樣品能否被適用於CC的進樣溶劑溶解。若分析物的log P值介於-2和9之間，就可以溶解。若此值小於-2，則該分析物只能溶於水性溶劑，因此可能不適用於CC。若分析物的log P值不明，則必須先用合適的有機溶劑溶解後才能進樣。請記住，合相層析的行為與正相層析分離較相近，甲醇等會是非常強的溶劑，而在逆相LC中它們是相當弱的溶劑。

因此，需使用較弱的溶劑（如庚烷/異丙醇）溶解（或稀釋）樣品。樣品溶解度和峰型必須達到平衡；本章稍早討論過CC中的樣品稀釋劑對峰型的影響。

除了選擇樣品稀釋劑以外，開發方法還需考量其他事項。例如，相關分析物適合哪些層析條件？圖34說明一組建議的通用起始條件，這組條件已知能夠滯留及分離多種分析物。與其他任何層析分離模式一樣，這些條件未必適用於每一種情況，可以採用一些策略來改善峰型並改變選擇性和滯留性。

針對這樣的情況，圖35、36和37顯示了能夠改善峰型、改變滯留性和選擇性的整體方法，這些方法與逆相LC所用的方法相去不遠。圖35所示為改善峰型的流程。初始起點是一組建議的條件，這組條件的依據是相關分析物主要屬於酸性或是鹼性。酸性化合物在酸性條件下更容易獲得較好的峰型，鹼性化合物在鹼性條件下更容易獲得較好的峰型。改善峰型的策略包括：試用不同的添加劑、改變添加劑的濃度，以及改變管柱充填材料。

圖36所示為提高滯留性的流程。與任何形式的液相層析一樣，首先是改用其他（較弱）的共溶劑。甲醇是CC所用最強的共溶劑；使用較弱的共溶劑（如乙腈或另一種醇類）能延長分析物在管柱中的滯留時間。拉平或降低梯度斜率（降低共溶劑最終百分比或增加梯度持續時間）或許也能發揮成效。混合共溶劑並降低甲醇濃度會減弱整體共溶劑的強度，從而提高滯留性。能控制管柱中的移動相密度是SFC和CC才有的特性。這樣會改變整體滯留性，因為密度降低相當於提高滯留性。降低ABPR設定和/或提高溫度就能做到這一點。最後，換用其他管柱充填材料也是提高滯留性的策略。

圖37所示為改變分離選擇性（洗脫順序、相對滯留性）的流程。試用不同的共溶劑（例如將甲醇換成乙腈）是一種方法。將一種醇類質子性共溶劑換成非醇類非質子性共溶劑（如乙腈）對選擇性所造成的影響遠大於將甲醇改成另一種醇類的影響。降低甲醇濃度會減弱整體共溶劑強度，因此可以提高滯留性及改變選擇性。控制移動相的密度也能改變整體分析物滯留性，因為這些密度所造成的影響因特定分析物而異，這樣可能足以讓特定分離發揮最好的成效。最後，這個流程還建議必要時試用不同的管柱充填材料。

管柱系列方法開發策略流程 - 方法2

上一節說明的方法開發流程著重於通用起始條件，以及改變移動相性質對微調分離的影響。本節介紹另外兩種替代流程，其中一種適用於掌性分離，另一種則適用於非掌性分離。這兩種替代流程皆須結合管柱和方法，在統計上能針對一大群不同的測試化合物發揮最高的成功率。一般而言，CC管柱選擇靠的是「蠻力」，但本節建議的流程則提出了一種逐步策略。

使用UPC² Trefoil管柱進行掌性分離的方法開發策略

建議用於掌性化合物的篩選流程採用了三種Waters UPC² Trefoil掌性充填材料：AMY1、CEL1和CEL2。圖38所示的篩選流程建議使用這種四步驟、四管柱的最佳路徑篩選方法，以及經過最佳化處理的共溶劑混合物，盡可能提高成功機率。

按照這個流程，首先應該使用含20 mM醋酸銨的乙醇:異丙醇:乙腈(1:1:1)混合物，以AMY1開始篩選。若這個方法達不到理想的分離成效，下一個方法應採用CEL1管柱以及含0.2% TFA的甲醇:異丙醇(1:1)混合物，以此類推。圖38的方塊中提供了詳細的方法條件。

使用UPC² Torus管柱進行非掌性分離的方法開發策略

非掌性分離的篩選流程都採行類似的方法。不超過三個步驟就能完成，如下方所述。

步驟1

首先使用Torus 2-PIC (3.0 x 100 mm)管柱以及下列層析分離條件進行快速偵察步驟：1.2 mL/min、3分鐘內MeOH從4%增加到50%、30 °C、2,000 psi BPR。

根據所得到的結果，記錄是否有以下情況：

a) 選擇性和峰型符合要求，如有需要才進一步進行方法最佳化

b) 選擇性良好但峰型需改進，若是如此，則使用添加劑（分析酸性化合物用甲酸，分析鹼性化合物用鹼性添加劑），然後再以Torus 2-PIC管柱重新分析。

c) 若數據顯示需要不同的選擇性，則繼續進行步驟2。

步驟2

根據樣品性質，選擇「既定篩選」流程中所述的適當路線。接著以建議的管柱和共溶劑組合繼續使用該流程，直到出現適當的分離效果為止。

步驟3

若要微調分離，可以調整方法共溶劑組成、溫度、添加劑和壓力，以發揮更好的分離效果。第4.7節中的圖說明如何以這種方式來發揮方法最佳成效。