合相層析初學者指南

上一章討論過，從分離的角度來看，CC與LC有許多相似之處。即使從儀器角度來看，CC在各方面也和LC系統相似（見圖7），只是多了一個元件：ABPR，作用是將整個系統加壓到高於某個設定點。為充分運用CO₂移動相的優點，並且讓它發揮UPLC的現代優勢，Waters改造了自家分散性低且耐壓的ACQUITY UPLC系統，使其關鍵系統元件能夠接受可壓縮溶劑，如CO₂。最值得注意的是，這套系統包含了液化CO₂幫浦，用於量測通過CC系統的流量。雖然CO₂會先液化（例如當溫度達到13 °C時），但它的可壓縮程度幾乎是甲醇或乙腈的三倍。因此必須改造幫浦，才能實現可再現的合相層析。

過去的分析級SFC系統所面臨的挑戰

過去，業界普遍認為分析級SFC系統不可靠，這些系統全都是改造後再利用的LC系統。專為LC設計的幫浦、進樣器和偵測器本就不適合壓縮CO₂。

單段往復式LC幫浦無法準確、重複且可靠地壓縮及輸送CO₂。這類幫浦並不是為用於CO₂這類可壓縮液體而設計，會導致移動相質量流速和質量成分出現變化。這種情況會改變移動相的溶劑化力，並且通常會導致不同進樣或不同系統之間出現滯留時間偏移。

CO₂移動相的可壓縮程度相當高，也容易因為幫浦和背壓調節器所發出的雜訊而導致分析靈敏度損失。同時，由於使用部分試樣環進樣會導致準確度和精準度不佳等嚴重問題，因此改造後再利用的HPLC儀器通常只能用於滿試樣環進樣，注射量選擇有限。在系統層面，改造後再利用的HPLC系統有一個特色，就是系統分散體積明顯更大，因此會導致不必要的譜帶擴散，從而無法使用更有效率的1.7 mm顆粒管柱。這些缺點大幅限制了改造後再利用的CO₂移動相LC系統的可行通量和效能。

接下來回顧ACQUITY UPC²系統中各項模組的創新設計（圖7）。

溶劑管理技術（幫浦）

為保證精準無誤地控制移動相流速和組成，我們需要瞭解系統的整個流路。如前所述，改造後再利用的HPLC幫浦是為了同時壓縮並準確輸送規定量的溶劑，因此不能處理CO₂這類可壓縮液體。在某些SFC儀器上，傳入的CO₂會通過一台裝置，進行預壓縮和冷卻。該裝置位於層析系統的旁邊（圖8）。這台裝置距離幫浦越遠，要準確控制CO₂質量流速就越難，因為CO₂密度可能會在預壓縮和抽吸階段之間因環境溫度而出現變化。此外，傳統SFC系統的抽吸演算法（內部控制軟體）通常適用於輸送相對無法壓縮的液體，難以保持成分的準確性、精準性，以及滯留時間再現性。嘗試可靠地輸送共溶劑百分比低（不超過5%）的移動相時，會發生相同的問題，因此採用這種系統難以分析極性多元的混合物。

相對而言，Waters ACQUITY UPC²雙幫浦溶劑管理器(BSM)是專為管理可壓縮流體而設計的，使用完全內建的預壓縮裝置完美控制質量流速和質量成分，使得滯留時間可靠且可再現，又幾乎不產生基線雜訊。如前所述，在可壓縮流體系統中，溶劑密度可控制移動相的溶劑化力，因此精準控制對於再現性相當重要。獨立的控制演算法對於可壓縮和不可壓縮液體成分至關重要，能準確混合不同的移動相組成（包括低百分比的共溶劑，圖9），而且能提供可再現的梯度曲線（圖10）。

分析級SFC系統過去從未達到如此精細的控制，特別是用於梯度分離時。ACQUITY UPC²系統的設計能夠精準控制幫浦進樣量、壓縮率和輸送量，因此能發揮極致效能液相層析所能達到的再現性。ACQUITY UPC² BSM所採用的體積密度控制優於質量流控制，因此能發揮優異的層析精準度。也因為如此，才能精準控制洗脫時間、充分控制溶解強度。幫浦頭本身具獨立冷卻功能，可加強CO₂的密度控制，因此能實現準確的質量輸送。幫浦和內建的壓縮演算法成效卓著，控制也相當精準，因此不論是液體或氣體CO₂都能用作初始移動相。圖11說明BSM的內部構造。共溶劑幫浦是UPLC幫浦，CO₂幫浦則在黑色絕緣蓋後方。由於壓縮和冷卻裝置內建於幫浦內，有了這個絕緣蓋，更能精準控制傳入之CO₂的密度。

進樣

進樣少量樣品時，傳統的分析級SFC系統（不論使用滿試樣環或是部分試樣環進樣器）很難發揮再現性。大多數情況下，唯有使用滿試樣環進樣能夠做到；若使用部分試樣環進樣，則難以保持進樣溶劑的同質性。因此難以保持準確性、精準性和線性，妨礙分析物定量。由於每次進樣都有可能浪費大量樣品，因此，必要時往往必須手動更換試樣環，而這會限制系統的靈活性。

ACQUITY UPC²樣品管理器採用創新的雙進樣閥設計（圖12）。這種設計會將主試樣環排空到廢液，使樣品能夠在大氣壓力下進入試樣環，同時保持移動相的同質性。此外，輔助進樣閥設計可減少進樣序列中的壓力脈衝並減少殘留，從而達到可重複且可再現的部分試樣環進樣（圖13）。能夠以0.1 μL遞增的方式進樣0.1到50 μL，並具備雙針頭沖洗選項，樣品殘留可忽略不計。圖14說明採部分試樣環進樣以1 μL遞增方式進樣1 mL到10 mL的進樣線性。

光學偵測

使用分析級SFC系統進行光學偵測有時相當麻煩。為HPLC系統所設計的偵測器流體槽可能會產生不可接受的分散體積和基線雜訊。折射率偵測器用於SFC時會放大幫浦系統所產生的雜訊，因此在處理可壓縮流體時會造成明顯的基線雜訊和曲率。甲醇和水等RPLC常用溶劑有著十分相似的RI值（圖15），因此逆相方法中的RI效應通常不明顯。CO₂的RI值與甲醇（最常用的共溶劑）的RI值截然不同，因此物質的折射率範圍會比在LC中的範圍大，導致基線雜訊增加，靈敏度受限。CO₂移動相的密度會隨著梯度分析的不同階段而改變，折射率也跟著改變，這又是更進一步的挑戰。

ACQUITY UPC² PDA偵測器專為可壓縮流體而設計。ACQUITY UPC² PDA偵測器並沒有採用在較低紫外線波長下會降低能量通量的藍寶石透鏡，而是採用由高強度二氧化矽製成的透鏡，能承受分離過程中產生的背壓。這種材質的透鏡有助於大幅提升靈敏度、減少基線雜訊，並且補償CO₂和有機共溶劑之間的RI效應差。光學透鏡台採用熱控制，能進一步提升基線穩定性並降低RI效應。低分散性的不鏽鋼流體槽能順應較窄的峰寬，而光程長度10 mm則能大幅提升靈敏度，同時保持最佳的光譜效能。由於能達到出色的靈敏度，因此能夠定量微量不純物（圖16）。

質譜(MS)偵測

為了配合使用可壓縮移動相，CC的光學偵測儀器有特殊要求，同樣，與CC聯用的MS也必須經過改造，以因應移動相的可壓縮性。CC-MS介面必須讓移動相能夠從壓縮狀態減壓到大氣壓水平，也就是現今的質譜儀離子源內部的壓力水平。若不仔細考量移動相的可壓縮性，分析物進入離子源的輸送過程可能會受到不利影響。分析物輸送不順利可能會導致峰型不佳和/或游離作用成效不彰。最糟的情況是不會發生任何游離作用，且質譜儀無法偵測到相關分析物。

壓縮移動相的減壓控制必須獨立於移動相流速、移動相組成以及自動化背壓調節器(ABPR)形成之管柱後系統壓力控制。再者，不能為了管理減壓過程而犧牲分析物輸送至離子源的效率。為達成這些目標，ACQUITY UPC²的質譜介面專門針對可壓縮移動相進行設計，採用了附補液功能的分流介面。質譜介面會透過分流限制器將恆定流速通常介於300和500 µL/min（壓縮狀態）之間的移動相引入質譜儀。剩餘的移動相則導入ABPR中，用於針對各種移動相流速和成分執行管柱後系統壓力控制。圖17是ACQUITY UPC²的質譜介面示意圖，圖中強調了分流介面和補液添加方式。

補液在CC-MS介面中發揮著多重作用。首先，在修飾劑只有大約5%的情況下，補液是電噴灑游離(ESI)的必要條件。ESI是一種液相游離技術，因此液體量必須要達到一定程度才能進行游離。若移動相修飾劑的百分比非常低，移動相所含的液體量就不足以進行ESI。所以，在修飾劑百分比較低的情況下進行ESI時，一定要以補液形式添加液體。再者，補液可以輔助分析物輸送。在分流限制器中的某個點，CO₂會從高壓緻密狀態轉為氣態，因而失去溶劑化力。因此，在CO₂轉為氣體後，只剩液體修飾劑能夠溶解分析物並將分析物輸送至離子源。若分離中採用的修飾劑比例是零或相當低，就沒有液體來輸送分析物通過分流限制器到達離子源進行游離。在此條件下，需要在分流限制器前端添加補液，以協助將分析物輸送至離子源。圖18舉例說明分析物輸送效果好壞狀態下的峰值曲線。這個範例透過選擇補液流速來考察分析物輸送效果不良(18A)以及輸送效果良好(18B)的情況。

當分析物在移動相液體修飾劑中的溶解度有限時，補液對於輸送分析物也相當重要。有時，分析物在液體修飾劑與壓縮二氧化碳的混合物中溶解度較高，但在單獨的液體修飾劑中溶解度較低。在這些情況下，即使存在高百分比的液體修飾劑，當分流限制器中的CO₂轉為氣態後，分析物也可能會在溶液中沉澱。分析物在液體修飾劑中的溶解度不足時，就會發生峰型不佳、介面管路阻塞和/或訊號峰再現性不佳等情形。適度添加補液能提高分析物在新形成之液體修飾劑和補液混合物中的溶解度，從而有助於避免這類問題。舉例來說，親脂性高的分析物在CO₂/甲醇移動相中的溶解度可能較高，而在單獨的甲醇中溶解度相對較低。在此情況下，添加非極性的補液有助於降低液體修飾劑和補液混合物的淨極性。這類親脂性分析物在低極性液體混合物中的溶解度更高，因此更容易輸送到離子源中。

必要時，也可以在CC-MS介面中添加補液，將游離增強型化合物引入質譜儀中。這些化合物可以在管柱之後添加，以免影響分離過程。游離增強型化合物（如體積佔5%的水和/或20 mM的氫氧化銨、甲酸或醋酸銨其中之一）通常可以提高ESI中的游離效率。游離增強型化合物的濃度和類型具有非常高的分析物專屬性，應根據不同的應用調整才能得到最佳訊號值。

選定補液成分後，還可以調整補液的流速以利得到最佳訊號值。可以根據MS訊號值篩選各種流速。補液流速太低可能會導致輸送效果不良，而流速太高往往又會減弱MS訊號。除了補液成分外，最佳補液流速也具有分析物和方法專屬性，如果需要最大的訊號值，就應根據不同的新應用進行最佳化。再者，倘若改變游離技術，例如從ESI改為大氣壓化學游離(APCI)，就該重新調整最佳補液成分和流速。

總之，ACQUITY UPC²的質譜介面經過專門設計，適用於可壓縮移動相，並且可連接採用大氣壓游離技術（如ESI、APCI、ESCi多模式游離、大氣壓光致游離(APPI)和UniSpray）的現代質譜儀。

背壓調節

不分系統，只要適用於處理壓縮溶劑，最重要的一項條件就是要能準確控制及保持系統內部的壓力。如我們剛才所見，背壓控制不夠精準會大幅影響移動相密度，進而影響分析物的溶解和滯留時間。傳統SFC系統往往因為諸多因素而無法精準無誤地控制背壓，例如：背壓調節器(ABPR)壓力監測成效不彰、反饋試樣環反應速度慢、步進馬達解析度不高、幫浦的壓力和流速控制不佳，以及隨著時間的推移ABPR元件效能退化。

ACQUITY UPC²系統採用創新的兩段式主動和靜態BPR（圖19），能發揮更好的背壓控制能力。透過主動和靜態背壓控制相結合，靜態BPR能讓系統保持盡可能低的壓力，而主動BPR則能增強控制使用者所定義的設定點（圖20）。為進一步提高穩固性，可加熱靜態匣式BPR，緩解移動相在ABPR出口處快速減壓可能發生的結凍現象。兩段式BPR位於ACQUITY UPC²合相管理器(CM)的內部（圖21）。這個模組還裝有內嵌顆粒濾器（用於過濾CO₂）、CO₂測漏器、排氣閥、洩壓閥以及輔助進樣閥。

整體系統效能

最後，ACQUITY UPC²系統原本就是低分散系統，與ACQUITY UPLC系統相似，能夠使用內徑和粒徑都更小的管柱（圖22）。窄內徑管柱能提高靈敏度、節省溶劑，並採用更適合質譜儀的流速。粒徑較小的管柱能提高分離效率並提升解析度。