合相層析初學者指南

任何一種層析分離的基本機制，無不在於形成讓樣品混合物中所有分析物分子可以在系統中移動（但不等速）的條件，使其自分析管柱中洗脫時，彼此之間充分分離，以利偵測和定量。為進行這個流程，層析系統必須包含兩項主要元素 - 固定相和移動相。固定相的主要作用在於阻止或擋住化合物的移動，而移動相的主要作用則是滯留化合物，同時強制化合物從系統的進樣端移動到出樣端。這就是GC、LC或CC的基本機制。CC和LC或GC的主要差別在於移動相性質對於不同層析行為的影響。

CC移動相與LC和GC移動相所發揮的作用比較

在GC中，移動相通常是惰性或不反應氣體，一般使用He或N₂。在GC的操作溫度和壓力下，移動相無法溶解分析物分子，也無法修飾固定相表面。GC移動相主要用作幫助分析物分子通過GC管柱的載體或驅動力。分析物的滯留和分離完全靠分析物分子與固定相之間的交互作用。相應的圖示說明見圖3，其中分析物分子週圍是空白區域。

另一方面，移動相在LC中發揮的作用比較活潑，其分子與分析物分子和固定相都會產生強烈的交互作用。移動相對分析物滯留性的影響除了在於能直接溶解分析物，更在於會爭奪固定相表面，進而影響分析物與固定相之間的交互作用（圖3）。 

圖3展示了RPLC模式和NPLC模式中的LC過程。請注意，這兩種LC模式的一個主要差別在於移動相組成：RPLC使用水性溶劑，而NPLC則使用有機溶劑。在RPLC中，水性移動相與C₁₈固定相結合，能充分改變分析物與固定相之間的交互作用，因此在解析各種化合物混合物中的樣品分析物時發揮相當重要的作用。在RPLC方法開發中，第一次修改往往是針對移動相而非固定相。相較之下，NPLC中的己烷或庚烷移動相作用相對溫和，化合物分離很大程度是靠改變固定相充填材料進行。

CC中移動相的作用大致介於RPLC和NPLC之間，這是因為CO₂（不論是否為超臨界狀態）具有特殊性質。壓縮CO₂是非極性溶劑，和庚烷或己烷一樣。就這一點來看，CC與NPLC較相近。但二者之間有一個重要差別，那就是CO₂能與極性共溶劑完全混合（例如甲醇、乙醇、乙腈），因此能用於梯度模式，而NPLC幾乎只用於等度模式。此外，CC對於移動相含少量水分的耐受性高於NPLC，在分析物洗脫中能發揮相當大的作用。

下一節會依據CC與RPLC和NPLC主要溶劑的性質差別系統地比較這幾種技術。

CO₂性質之於影響層析分離行為的作用

CO2與其他溶劑的混溶性

CO₂是非極性溶劑，其極性指數和庚烷的極性指數(=0.1)相近。但不同於庚烷之處在於，CO₂的四極矩並非為零(-13·4 ± 0·4 × 10^–40 C m²)，且能與強極性有機溶劑完全混溶，例如乙腈（極性指數 = 5.8）和甲醇（極性指數 = 5.1）。雖然很少與水（極性指數 = 10.2）混溶，但能與含水比例相當高的甲醇/水、異丙醇/水或乙腈/水等混合物混溶。CC移動相的混溶性如此廣泛，因此其極性延伸範圍遠大於NPLC和RPLC移動相。表1簡明地展示了RPLC、NPLC和CC所用溶劑的洗脫（洗脫強度）值和極性指數的情況。

請注意，表1中RPLC的水性移動相能運用的洗脫序有限，這是因為水與大多數其他有機溶劑的混溶性均有限。NPLC的情況類似，乙烷/庚烷移動相的洗脫範圍不大，原因在於非極性有機溶劑與強極性溶劑的混溶性有限。NPLC的另一個問題在於，並非所有有機溶劑彼此之間都能廣泛混溶，因此某些混合物會無法相容。另一方面，在CC中，壓縮CO₂能與整個洗脫序的所有其他溶劑混溶，自然能有眾多適用的移動相，因此會影響分離的選擇性（見表1）。雖然CO₂是非極性溶劑，但CC與RPLC相當，因為其洗脫強度範圍比NPLC更大，尤其是在洗脫強極性化合物方面。舉例來說，若CO₂與甲醇結合，移動相的洗脫強度設定範圍就能從0到0.73E^o。

除了洗脫範圍更大以外，CC的CO₂移動相還能與大多固定相充填材料相容。表2列舉NPLC和RPLC常用的固定相。大多數RPLC分離使用C₁₈固定相，使用其他鍵結相的情況相對較少。RPLC完全無法使用表中所列的某些固定相，因為這些固定相的極性較強。NPLC與此類似，管柱選擇性會受限於移動相的極性範圍。而CC由於極性範圍較廣，因此可以選擇表中所有管柱充填材料，選擇性更加廣泛（見圖4）。如West和Lesellier所言，這些充填材料全都適用於相同的移動相組成，因此有機會將極性完全不同的管柱合併運用。

CO₂的混溶性之所以重要，另一個原因在於CC能相容於各種樣品稀釋劑（溶解或稀釋樣品的溶劑）。CC的這項特色大幅影響實驗室的整體工作流程。層析實驗室最大的瓶頸往往在於樣品前處理。大多數常用的樣品前處理方法會讓相關分析物溶解於無法與現有LC系統相容的溶劑中。例如，許多分析物很容易就能溶於有機溶劑中，因此使用這類溶劑的萃取效果非常好。由於RPLC無法與有機溶劑含量高的溶液相容，因此通常必須額外進行一些步驟，將這種溶液轉換成能與RPLC相容的有機溶液或萃取物（圖5）。CC能夠直接進樣溶於有機溶劑中的樣品，因此可以省略逆相分離流程中將有機溶劑蒸發並將樣品回溶於水性稀釋劑（相當耗時）等必要步驟。這種方式能夠節省相當可觀的整體分析成本。此外，分析時間也會大幅縮短，這會造成相當具有象徵意義的整體影響，對於需要執行多套RPLC系統來分析大量樣品的實驗室來說更是如此。

簡而言之，將非極性壓縮CO₂與共溶劑（不論其洗脫譜偏向哪一端）相結合，再加上CC相容於更多種固定相的特色，自然能夠提供更大的選擇性範圍，這也是CC能克服相當多種分離處理的原因。

CO2輸送特性

CC還有另一項性質優勢，就是CC移動相的黏度低，因此分析物分子在移動相中的擴散率高。從物理性質的角度觀點來看，層析分離管柱的效率取決於分析物在移動相中的擴散率。分子擴散率越高，進出固定相顆粒孔隙中的速度就越快，這樣一來，即使移動相速度快，也能發揮相當高的效率。在CC中，即便加入大量液體修飾劑（例如CO₂/甲醇，70/30，mol/mol %），移動相黏度至少也會是LC移動相的一半（見表3）。這就表示，CC可以在更高的移動相流速下運作，不會影響管柱效率。所以CC非常適合用於高通量分析。

CC的優勢在兩個重要應用領域發揮得特別顯著：快速掌性篩檢和替代非掌性分離的正相層析。就掌性篩檢而言，分析時間能從20分鐘縮短到只要3分鐘，不但節省了七倍的時間，還能提高解析度。這種進步得益於CC採用的溶劑梯度，這是在NPLC中做不到的。CC的另一個好處是溶劑消耗量更少，有助於省下可觀的成本。

將正相有機溶劑換成主要以壓縮CO₂組成的移動相（圖6），能夠將每個樣品每次分析的成本從大約六美元降低到只花五美分。縮短分析時間、減少溶劑採購量及廢液處理成本，種種優點結合起來會對整體財務造成相當驚人的影響。

其他有利特性所發揮的作用

表4列舉CC移動相勝過LC移動相的優點。除了混溶性和低黏度等優勢之外，CC的表面張力也比較低。表面張力低的移動相可以更快進入固定相顆粒的孔隙，因此能加快管柱平衡過程。

CO₂的其他特性是價格較低，操作起來更安全，而且更耐用，CC也因此成為相當具有吸引力的層析分離系統。CO₂容易獲取，也不需要進行任何其他重要製程（例如石油化工業製造出乙腈這種副產品的製程）。商用級CO₂具碳中和特性，屬於綠色溶劑。CO₂的成本遠低於其他有機溶劑，而且可以直接將CO₂釋放到空氣中（如果不需回收再利用），不需要任何廢液處理成本。

CO₂不易燃、無毒，並且易於保存。不會有其他移動相能夠結合CO₂的混溶性和低黏度兩種特性，並能像CO₂一樣兼具經濟實惠與環保等優點，因此，CC在許多應用中比LC更優異。表4列舉CO₂的所有特性，這些特性的優勢結合起來使其成為獨一無二的溶劑。

是否達到超臨界狀態？

如前所述，從層析分離的角度來看，CC並不注重移動相是否達到超臨界狀態。不過，CC移動相必須具有同質性，不能是氣體和液體的異質混合物，否則就無法進行層析分離。CC移動相必須維持在一定的壓力以上，才能保持同質性，使用自動化背壓調節器(ABPR)可以輕鬆設定壓力。