合相層析初學者指南

如前文所述，合相層析的選擇性相當廣泛，因此這項技術適用於各種應用（表5）。

不論在哪個市場領域，也不論所驗分析物的確切性質為何，CC均能發揮以下三大作用，有助於克服分析挑戰：

• 合相層析能簡化工作流程
• 合相層析能分離結構相似的化合物
• 合相層析是逆相LC的正交分離模式

以下舉幾個應用範例解釋CC的主要優勢。

在SFC到CC的演進過程中，最有用的一項發現是，壓縮CO₂可以與各種有機溶劑混合，以前所未有的方式進行層析分析。本節將說明CC如何大幅簡化分析實驗室中的工作流程。

對於任何分析實驗室而言，從最初樣品收集到最終分析，簡化任一環節的工作流程通常都會對業務產生巨大影響。CC能夠大幅簡化許多應用的工作流程，不但能節省成本和時間、降低出錯風險，也有助於提高生產力。其中幾項簡化作業包括：

• 結合多種技術（LC和GC）
• 結合多種方法（正相LC和逆相LC）
• 縮短樣品前處理時間

結合多種技術 – 脂質分析

基於多種原因，分析脂質相當重要。製藥業會研究脂質分佈，從而測定對照組受試者與給藥組受試者體內的藥效影響。

在臨床研究中，脂質含量可以用作不同疾病的生物標誌物，還能衡量治療效果。在食品應用中，會透過分析特定類別的脂質（如三酸甘油脂）來評價營養水平或判斷產品真偽。在化學材料領域，會分析諸如生質柴油等石化製品所含的脂肪酸和三酸甘油脂。目標不同，脂質分析所需採用的技術也不同。游離脂肪酸分析通常使用GC，並且必須將游離脂肪酸衍生化處理成脂肪酸甲酯(FAME)，以利改善峰型和偵測極限，尤其是用於碳鏈較長的游離脂肪酸時。衍生化處理可能要花上數小時的時間，而且隨後的GC分析要等三十分鐘。極性較強的脂質（如磷脂和鞘脂）通常需要以HILIC或正相LC來分離不同類別的脂質（依據極性頭端基的性質）。接下來，依據碳鏈長度和/或雙鍵數目，使用逆相LC鎖定同類脂質中疏水性更強的化合物。如上所述，完整的脂質分析需要運用多種技術。CC則非如此，只需進樣一次就能分離所有類別的脂質。圖40是使用ACQUITY UPC²系統分析小鼠心臟萃取物得到的全面脂質分佈結果。這個範例以BEH管柱和通用梯度來分離不同類別的脂質，其分離效果與正相LC或HILIC的分離效果類似。

如用於中性脂質（即三醯甘油脂(TG)、二酸甘油脂(DG)、膽固醇酯(CE)和游離脂肪酸），只需改變管柱和梯度條件，即可根據脂肪酸鏈長和雙鍵數目滯留並分離每一類別的不同脂質（圖41）。

就此應用而言，CC不但速度比GC快（最高快上10倍），而且不需要衍生化處理，因此能大幅簡化脂質分析的整體工作流程。省略衍生化處理步驟能夠節省時間，而且盡可能避免工作流程因為多出這些步驟而出錯。若沒有CC技術，這類分析和標靶分析最多可能必須採用至少三種不同的技術，不但會降低樣品通量、增加溶劑使用量、拉長分析時間，還會增加整體分析成本。

結合多種LC方法 – 脂溶性維生素

脂溶性維生素分析對製藥業、臨床研究和診斷以及食品/燃料產業相當重要。脂溶性維生素和類胡蘿蔔素的分析通常採用逆相或正相LC技術（表6）。由於以單次進樣分離這些化合物具有一定的難度，因此會使用不同的管柱和移動相分別分析不同的化合物，分析時間約需10到30分鐘。相較之下，CC只需不到10分鐘就能分析所有維生素和相關化合物（圖42）。不同於表6所列的傳統分析方法，簡化的CC方法只需要使用一支管柱、一個移動相條件和一台偵測器。CC可以直接進樣溶劑，通常就是萃取或溶解這些化合物時所用的溶劑（如異辛烷和己烷），不像逆相分析必須換溶劑。

縮短樣品前處理時間

除了能夠將多種技術和方法合而為一，從而加快分析物的分離速度以外，CC通常還能縮短樣品前處理時間。CC能與有機溶劑相容，因此能發揮以下優勢：

• 可以省略水解或衍生化處理步驟
• 可以省略換用溶劑所需的蒸發和回溶步驟
• 減少處理步驟，從而降低實驗出錯率並提升數據品質

舉例來說，要分析食品所含的脂溶性維生素，通常需要執行多個樣品前處理步驟和多次分析。分析食品所含維生素A、D和E的典型工作流程範例見圖43。注意看，維生素A和E所需的樣品前處理程序不同於維生素D。此外，每種維生素各須進行三次不同的HPLC分析（正相和逆相）。維生素D分析的樣品前處理過程特別繁複，包含許多步驟，有時甚至還包括半製備級HPLC步驟。

使用CC分析相同維生素的樣品前處理程序簡單得多（圖44），原因在於這項技術能與萃取流程早期階段使用的非極性有機溶劑相容。在此範例中，只要直接進樣用已烷萃取的樣品，就能定量維生素E。之後將樣品濃縮，再用於分析維生素A和D3，分析時間比傳統分析方法快上二十倍。此外，CC只需要三個樣品前處理步驟、一種方法和一台儀器，而圖43所示的傳統工作流程則必須使用兩種不同的儀器進行12個樣品前處理步驟，並使用三種方法。表7總結了CC在前述應用中的優點，並且強調分析科學家將從類似簡化流程中獲益的其他應用。

快速分離結構相似化合物

由於結構相似，異構物和結構類似物有時難以分離，光學異構物尤其如此。現在討論CC在分離下列結構相似化合物中的運用：

• 掌性分離（鏡像異構物和非鏡像異構物）
• 位置異構物（官能基的位置不同）
• 結構類似物
  • 生物標誌物（結合型和未結合型）
  • 藥物（代謝物、不純物、降解物）

化合物的不同鏡像異構物可能具有不同的效力和毒性特徵，因此，在整個研究、開發和生產階段全程皆須進行監測。掌性分離主要以正相LC進行，會使用纖維素和直鏈澱粉基固定相。正相LC通常不容易進行梯度分離，必須使用不同的管柱、不同的移動相組合，進行不同的等度分析，而且通常會使用高毒性溶劑。方法開發流程相當耗時。CC則採用無毒溶劑，能進行梯度分析且選擇性相當廣泛，讓分析科學家只要一天就能開發出掌性分離方法。

純化化學家多年前即已肯定SFC之於這類分離技術的價值。分析級SFC分離要做得正確固然不易，但用於掌性快篩、掌性方法開發、鏡像異構物過量測定以及掌性反轉研究卻非常理想。不同於正相LC，CC能與質譜偵測高度相容，因此能鑑定鏡像異構物及其在反應過程、製造過程以及生物體系中的形成，以及進行表徵分析（圖45）。

圖46比較了以正相及合相層析分離Warfarin鏡像異構物的不同之處。CC只用正相層析的一小部分時間就實現了鏡像異構物的基線解析（速度快了30倍）。此外，由於不需要使用購買及處置成本均很高的有毒溶劑，每次進行掌性分離的分析成本省下多達100倍。以上所有優點讓CC成為最適合用於各類掌性分析的技術。

位置異構物和結構類似物

CC非常適合用於分離位置異構物和結構類似物。位置異構物是分子量相同（同量異位）但官能基位置不同的化合物。通常會出現在原料分析、反應監測以及不對稱催化等相關應用領域。這些化合物在進行GC分析之前通常需要衍生化處理以利分離異構物。正相LC方法存在穩固性差、分析速度慢的固有問題。另一方面，CC分離方法的選擇性廣泛，能在一組通用條件下輕鬆分離位置異構物，不需要衍生化處理。

ACQUITY UPC²系統（圖47）分離異構物的速度相當快，有助於即時評估反應原料、中間體和最終產物的最佳化效果。結構類似物彼此之間的相似度相當高，因此難以分離，這類物質包括結合型和未結合型（例如葡糖苷酸、硫酸鹽）生物標誌物，以及藥物化合物的代謝物、降解物及不純物。類固醇是應用最廣泛的一類結構類似物（圖48）。不同類固醇之間的結構相似，即使借助MS偵測也難以分離和分析，因為質量差異很小。使用CC，在多種管柱上執行通用篩選梯度就能輕鬆解析不同的類固醇，用時不到兩分鐘（圖49）。由於化合物的性質屬於非極性，這種分離對於逆相LC來說具有挑戰性，而使用GC又必須進行衍生化處理才能改善峰型和偵測極限。ACQUITY UPC²系統與MS偵測器結合使用是鑑定和定量類固醇的有效方法。

分離結合型結構類似物的難度更大。游離類固醇（圖48）不溶於水，因此人體會將這類類固醇轉換成硫酸化形式的水溶性衍生物。這個流程會產生帶負電荷的親水性側基，使其可溶於水（圖50）。這些化合物分離自天然來源，用於疾病治療，可以用作生物標誌物，以利研究疾病並確定治療效果。這類化合物的分析有兩大挑戰。

首先，一次30分鐘的GC分析，樣品前處理流程就需要2.5小時，必須先進行硫酸鹽基團的酶水解，再進行衍生化處理。其次，有些雌激素為同量異位物（m/z相同），使用質譜技術也無法區別。因此，需要以層析技術分離不同形式的同量異位化合物。

CC能在15分鐘內分離全部10種硫酸化雌激素（圖51），包括兩個相鄰洗脫峰（峰6和7），這是30分鐘的GC分析都無法做到的（圖52）。CC不要求必須水解及衍生化處理樣品，因為可以分析硫酸化化合物的原型。這樣有利於大幅減少分析治療配方所需的步驟，因此能提高通量和生產力。

表8總結了CC用於前述應用的優點，並且強調分離鏡像異構物、位置異構物以及結構類似物等其他應用領域。

正交性

正交分離模式彼此相輔相成，但滯留峰的方式各不相同，相較於只採用一種分離模式，這樣做能得到更多與樣品相關的資訊。使用不同技術解析分析物的能力非常重要，原因如下：

• 能夠可靠地鑑定和表徵分析不純物、降解峰或類似化合物（如同量異位化合物或共洗脫化合物）
• 能全面表徵分析樣品
• 能得到更多的樣品相關資訊
• 能從基質干擾物中分離出所需化合物

正交分離技術的範例包括相輔相成的模式，例如正相層析和逆相層析。CC的選擇性與正相層析相似，但比任何正相方法都更穩固、更可靠（見第2章），再現能力也更強。下一節舉例說明以正交分離模式使用CC達成前列目標的方式。

使用ACQUITY UPLC和ACQUITY UPC²系統分離活性藥物成分（美多普胺）及其相關物質的結果證明了這種正交性（圖53）。某種技術無法解析的峰就用另一種技術來解析，反之亦然。CC滯留極性化合物的時間比RPLC長（例如峰1和峰2）。在這個範例中，ACQUITY UPC²系統解析了一對關鍵分析物（峰5和美多普胺），有助於更大規模地純化和分離不明化合物，用於隨後的鑑定和表徵分析。這一切優點使CC成為適合與其他技術搭配使用的理想技術，有助於克服各式各樣的分離挑戰。

正交方法對於分離相關分析物與基質干擾物也很重要，例如在生物分析或食品分析中。

圖54A是一個典型範例，顯示了使用蛋白質沉澱法從人血漿中萃取Clopidogrel的LC-MS/MS層析圖。Clopidogrel具有疏水特性，因此在分析過程中的洗脫時間相當晚。干擾性磷脂（具有含膽鹼的頭端基）也在同一區域洗脫（圖54B），可能會對Clopidogrel峰造成離子抑制，並引起定量結果變化。有趣的是，使用ACQUITY UPC²系統時，干擾性磷脂在同一區域洗脫（圖54C）。由於CC與逆相LC的正交性，相關分析物會更早洗脫，並且遠離這些干擾性磷脂（圖54D）。這樣能盡可能減少發生基質效應的機會，讓定量更加精準無誤。

這些優勢都證明了本章稍早提過的CC的三大特性：

1. 合相層析能簡化工作流程
2. 合相層析能分離結構相似的化合物
3. 合相層析是逆相LC的正交技術

• 多種技術合而為一
• 縮短樣品前處理時間與分析時間
• 可用於直接進樣有機溶劑/萃取物

• 鏡像異構物（掌性）
• 位置異構物
• 結構類似物和結合物

• 更加可靠地鑑定不純物/降解物
• 全面的樣品表徵分析
• 分離分析物與基質干擾物