Manual de espectrometría de masas

Ionización por impacto electrónico (EI)

Muchos están familiarizados con la ionización por impacto electrónico (EI).(A veces se utiliza la expresión anterior «impacto electrónico», aunque técnicamente es incorrecta). La EI, que a menudo se realiza exponiendo una muestra a electrones de 70 eV, se denomina técnica «dura». La energía de los electrones que interactúan con la molécula de interés suele ser mucho mayor que la contenida en sus enlaces, por lo que se produce la ionización. El exceso de energía rompe los enlaces de forma bien caracterizada. El resultado son fragmentos predecibles e identificables a partir de los cuales se puede deducir la identidad de la molécula. La abstracción de solo un electrón de la capa externa produce un catión radical en modo positivo (M.+) y un amplio espectro de fragmentos. A diferencia de las técnicas de ionización atmosférica más «suaves», que producen una respuesta espectral a veces característica del diseño de la fuente particular del fabricante, la técnica EI es bastante independiente del diseño de la fuente. Un espectro producido por un instrumento EI se parece mucho al espectro del mismo compuesto de otro instrumento EI, un hecho que se presta a crear bibliotecas de espectros para hacer coincidir las incógnitas con los espectros de referencia.

Ionización química (CI)

Las moléculas que se fragmentan excesivamente requieren técnicas «suaves».La ionización química (CI) produce iones mediante un proceso de transferencia de protones más suave que conserva y favorece la apariencia del propio ion molecular. La muestra está expuesta a un exceso de gas reactivo, como el que se desprende cuando el metano forma el ion molecular protonado (M+H). El proceso inverso puede producir iones negativos. En algunos casos, transferir el protón a la molécula de gas puede producir el ion negativo (M-H).

La ionización química (CI) se utiliza a veces para compuestos con una química similar a los analizados por EI con el fin de mejorar la abundancia o la apariencia del ion molecular en favor de una fragmentación significativa. Al igual que con EI, las muestras deben ser térmicamente estables, ya que el calentamiento de la fuente causa la vaporización. El mecanismo de ionización de CI se basa en la EI para el paso de ionización inicial, pero dentro de la fuente hay un gas reactivo químico a alta presión, como metano, isobutano o amoníaco. El gas reactivo, que está presente en una concentración mucho más alta que el analito (R), se ioniza por ionización por impacto electrónico para producir R+ primario.iones reactivos. La colisión del R +.Los iones con moléculas R neutras conducen a la formación de iones secundarios estables que son las especies reactivas que luego ionizan las moléculas del analito (A) mediante reacciones iónico-moléculas.

Por ejemplo, la reacción ion-molécula entre un ion metano y una molécula de metano da lugar a especies de CH₅⁺ bastante estables.

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

El ion reactivo CH₅⁺ puede ionizar moléculas de analito neutras (A) por transferencia de protones, abstracción de hidruros o intercambio de carga.

RH⁺ + A --> R + AH⁺ (transferencia de protones)

(R-H)⁺ + A --> R + (A-H)⁺ (abstracción de hidruros)

R+^. + A --> R + A^+.(intercambio de carga)

Las reacciones de ionización más comunes son la protonación, que es favorable para las moléculas con afinidades de protones más altas que el reactivo. La abstracción de hidruros es común para moléculas de menor afinidad por protones y el intercambio de carga se produce con reactivos de alta energía de ionización.

La sustancia que se va a analizar está a una presión mucho más baja que el gas reactivo. Si se considera el metano como gas reactivo, el impacto de los electrones provoca principalmente la ionización del metano. Esto se fragmenta en parte en CH₃⁺ A continuación, estas especies experimentan reacciones de moléculas de iones bajo las altas presiones de la fuente empleadas.

CH₄^+. + CH₄  --> CH₅⁺ + CH₃^.

CH₃⁺ + CH₄  --> C₂H₅⁺ + H₂

El CH₅⁺ puede actuar como ácido de Bronsted y el C₂H₅⁺ como ácido de Lewis para producir iones a partir del analito.

La elección cuidadosa del gas reactivo de CI puede mejorar la transferencia de carga a una molécula de analito, ya que la acidez de la fase gaseosa del gas de ionización química influye en la eficacia de la transferencia de carga. En CI es más probable que el analito dé lugar a un ion molecular con la fragmentación reducida que conserva la energía normalmente internalizada en EI para romper los enlaces.

Ionización química de ionización negativa (NCI)

Se puede realizar una variación, la ionización química negativa (NCI), con un analito que contenga elementos que capturen electrones (p. ej., átomos de flúor o grupos de nitrobencilo). La sensibilidad puede ser muchas veces mayor que la de EI (en algunos casos, se informa que es de 100 a 1000 veces mayor). La NCI es aplicable a una amplia variedad de moléculas pequeñas que están modificadas químicamente (o que pueden estarlo) para promover la captura de electrones.

En el ion negativo hay dos mecanismos principales por los que se producen los iones negativos: la captura de electrones y la ionización química del ion reactivo. En condiciones de CI, las moléculas electronegativas pueden capturar electrones térmicos para generar iones negativos. La verdadera ionización química con ionización negativa se produce por la reacción de un compuesto analito (AH) con iones reactivos cargados negativamente (R^-.o R^-). Pueden producirse varios tipos de reacciones ion-molécula, siendo la más común la abstracción de protones.

AH + R^-  --> A^- + RH

A medida que aumenta la afinidad protónica (basicidad) del ion reactivo, es más probable que se produzca la abstracción de protones.

Cromatografía de gases (GC).

Quizás el primer encuentro con un espectrómetro de masas para muchos sea como el detector para un cromatógrafo de gases. La gama de tipos de instrumentos de GC-MS se ha ampliado para trascender las limitaciones de los diseños de instrumentos anteriores o para cumplir con la legislación cada vez más estricta en aplicaciones como el análisis medioambiental, el cribado de seguridad alimentaria, la metabolómica y las aplicaciones clínicas, como el análisis forense, la toxicología y el cribado de fármacos.

En el pasado, dos tipos de espectrómetros de masas dominaban el análisis de GC-MS: los instrumentos de sector magnético y de un solo cuadrupolo. El primero, que ofrecía análisis de masa exacta y de alta resolución, se utilizaba en aplicaciones que requerían una sensibilidad extrema. El último realizaba el análisis rutinario de los compuestos diana.

Los análisis de GC-MS que suponían un reto mayor se reservaban para los instrumentos del sector magnético: dioxinas en muestras ambientales/industriales o cribado del uso ilegal de drogas para mejorar el rendimiento en deportes de competición. Los niveles de detección de femtogramos, a alta resolución/selectividad, se logran fácilmente en los instrumentos de sector magnético.

Poco después de su introducción, los sistemas GC-MS de cuadrupolo ganaron aceptación en las aplicaciones de análisis de objetivos. Los métodos de la USEPA exigían el uso de instrumentos GC-MS de cuadrupolo para analizar muestras en busca de numerosos contaminantes ambientales. Debido a que esas aplicaciones solo requieren niveles de detección de picogramos a nanogramos, la menor sensibilidad del cuadrupolo en relación con el sector no era una limitación. Por el contrario, el coste muy reducido, la facilidad de uso y la portabilidad resultaron ser una ventaja.

Cromatografía líquida (LC)

La tecnología revolucionaria que nos brindó acceso analítico a aproximadamente el 80 % del universo químico inalcanzable por GC también es responsable del increíble crecimiento y del interés en la espectrometría de masas en las últimas décadas. Se seleccionan algunos individuos (véase la sección «Una breve historia») para acoplar la LC con la MS. Podría decirse que a partir de la década de 1970, la LCMS, tal como la conocemos hoy, alcanzó su madurez a principios de la década de 1990. Muchos de los dispositivos y técnicas que utilizamos hoy en día en la práctica proceden directamente de esa época.

La cromatografía líquida se definió a principios de la década de 1900 gracias al trabajo del botánico ruso Mikhail S. Tswett. Sus estudios se centraron en separar los pigmentos de las hojas extraídos de las plantas mediante un eluyente en una columna llena de partículas. En su forma más simple, la cromatografía líquida se basa en la capacidad de predecir y reproducir con gran precisión interacciones competitivas entre analitos en una solución (la fase móvil o condensada) que pasan sobre un lecho de partículas empaquetadas (la fase estacionaria). El desarrollo de columnas empaquetadas con una variedad de elementos funcionales en los últimos años y los sistemas de suministro de eluyentes capaces de suministrar con precisión la fase móvil han permitido que la LC se convierta en la columna vertebral analítica para muchos sectores.

El acrónimo HPLC fue acuñado por Csaba Horváth en 1970 para indicar que se utilizaba una alta presión para generar el flujo necesario para la cromatografía líquida en columnas empaquetadas. Los continuos avances en el rendimiento desde entonces, incluido el desarrollo de partículas más pequeñas y una mayor selectividad, también hicieron que el significado del acrónimo cambiara a cromatografía líquida de alta resolución.

En 2004, nuevos avances en la tecnología de instrumentos y columnas lograron aumentos significativos en la resolución, la velocidad y la sensibilidad en la cromatografía líquida. Las columnas con partículas más pequeñas [1,7 micras] y la instrumentación con capacidades especializadas diseñadas para suministrar la fase móvil a 15 000 psi [1000 bar] pasaron a conocerse como tecnología UPLC, que representa el término diferenciado de cromatografía líquida de ultra rendimiento. Gran parte de lo que incorpora esta tecnología actual fue predicho por investigadores como John Knox en la década de 1970. Knox predijo que los diámetros óptimos de partículas serían de 1 a 2 m y la cromatografía sería térmicamente sensible al calor por fricción. La tecnología capaz de desarrollar pequeñas partículas robustas y uniformes se encontró y resolvió necesariamente en el camino hacia el desarrollo de una UPLC para un uso generalizado.Vea un buen cebador básico en HPLC y UPLC.

Electrospray (ESI)

El término general «ionización a presión atmosférica» (API) incluye la técnica más notable, la ionización por electrospray (ESI), que proporciona la base para diversas técnicas relacionadas capaces de crear iones a presión atmosférica en lugar de en vacío. La muestra se disuelve en un eluyente polar (normalmente menos volátil que el que se utiliza con la GC) y se bombea a través de un capilar de acero inoxidable que transporta entre 2000 y 4000 V. El líquido se pulveriza al salir del capilar a presión atmosférica, las gotas que se desprenden sueltan iones que fluyen hacia el espectrómetro de masas, inducidos por los efectos combinados de la atracción electrostática y el vacío.

El mecanismo por el cual el potencial se transfiere del líquido al analito, creando iones, sigue siendo un tema de controversia. En 1968, Malcolm Dole propuso por primera vez el mecanismo de carga y residuo en el que planteó la hipótesis de que a medida que una gota se evapora, su carga permanece sin cambios. La tensión superficial de la gota, que en última instancia es incapaz de oponerse a las fuerzas repulsivas de la carga impuesta, explota en muchas gotas más pequeñas. Estas fisiones culómbicas se producen hasta que solo quedan gotas que contienen un único ion analito. Cuando el eluyente se evapora de la última gota, se forma un ion en fase gaseosa.

En 1976, Iribarne y Thomson propusieron un modelo diferente, el mecanismo de evaporación de iones, en el que se forman pequeñas gotas por fisión culómbica, similar a la forma en que se forman en el modelo de Dole. Sin embargo, de acuerdo con la teoría de la evaporación de iones, la intensidad del campo eléctrico en la superficie de la gota es lo suficientemente alta como para que abandonar esta superficie y pasar directamente a la fase gaseosa sea energéticamente favorable para los iones solvatados.

Es posible que los dos mecanismos funcionen realmente en conjunto: el mecanismo de carga y residuo es predominante para masas superiores a 3000 Da, mientras que la evaporación de iones se usa más para masas más bajas (véase R Cole, Some tenets pertaining to Electrospray ionization mass spectrometry, J of Mass Spec, 35, 763–772 (2000).

El líquido del cromatógrafo de líquidos entra en la sonda ESI en un estado de equilibrio de carga. Por lo tanto, cuando el eluyente sale de la sonda ESI, lleva una carga iónica neta. Para garantizar que la ESI sea una técnica continua, la solución debe cargarse mediante reacciones electroquímicas en las que los electrones se transfieren a una superficie conductora que actúa como electrodo. Entre otros efectos, este proceso puede provocar cambios en el pH. Se asume que, en el modo positivo, las gotas con carga positiva salen del aerosol y el electrodo acepta los electrones (oxidación). (Lo contrario sería cierto en modo negativo). El área de la superficie del electrodo electroactivo, la magnitud de la corriente y la naturaleza de las especies químicas y sus potenciales de electrodo ejercen un efecto.

Sobre todo, ESI es un proceso eficiente. Sin embargo, la energía de activación y la diferencia de energía para la reacción, en total, varía para cada especie. El caudal de la solución y la corriente aplicada definen los límites para cada gota. Se produce competencia entre las moléculas y no es poco frecuente la supresión de analitos de interés.

Las extensiones de la teoría de ESI básica, como la reducción del líquido a volúmenes extremadamente bajos (por ejemplo, a 30 nL/min en el caso de la nanopulverización) han demostrado su eficacia, especialmente en estudios de proteínas y aminoácidos con muestras limitadas.

Ionización química a presión atmosférica (APCI)

Aunque el trabajo de demostración de APCI se publicó en paralelo con el de demostración de ESI, APCI no se adoptó ampliamente hasta que se comercializó ESI, lo que ocurrió a raíz del trabajo de Fenn en 1985.

Horning introdujo APCI por primera vez en 1973 para analizar compuestos volátiles mediante varias técnicas de introducción, una de las cuales fue la HPLC. La capacidad adjunta de APCI permite que los analitos que se resisten a la conversión a iones en fase gaseosa por ESI, los menos polares y más volátiles se introduzcan en un espectrómetro de masas desde una corriente en fase condensada o líquida. A diferencia de la ESI, la APCI transfiere los analitos neutros a la fase gaseosa mediante la vaporización del líquido introducido en una corriente de gas caliente. La ionización química se basa en la transferencia de especies cargadas entre un ion reactivo y una molécula objetivo para producir un ion objetivo que puede analizarse en masa. Lo más habitual, en el modo de ionización positiva, es que se forme un aducto entre la molécula diana y el ion H⁺ pequeño, aunque también son comunes los aductos con sales. Por ejemplo, el aducto de amonio puede formar (M+NH₄)⁺ cuando la sal de ácido débil y base débil, el acetato de amonio, está presente en la fase móvil, un modificador que se utiliza a menudo en lugar del tampón fosfato, menos volátil y altamente iónico. A concentraciones de sal más altas, la competencia entre las formas protonadas y de amonio puede producir una disminución de la respuesta para ambas. El número máximo de iones que puede formarse mediante APCI es mucho mayor que en ESI porque los iones reactivos se forman de forma redundante. El líquido se empuja a través de un tubo no conductor, generalmente de vidrio de sílice fundido, alrededor del cual fluye un gas de nebulización. Las gotas finas resultantes chocan con la pared interna calentada de un tubo o sonda que se extiende más allá del extremo del tubo no conductor y, por lo tanto, se convierten en la fase gaseosa. Este tipo de ionización se suele realizar a velocidades lineales mucho mayores que las de los caudales de HPLC o la cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) normalmente asociados con al electrospray. Sin embargo, los instrumentos actuales proporcionan capacidades de desolvatación mucho mayores que mejoran el rendimiento de todas las técnicas dependientes de aerosoles.

A continuación, las moléculas de analito desolvatadas se ionizan mediante ionización química. El potencial ionizante no se aplica a través del líquido como en ESI, sino en la punta de una aguja como plasma o corona, a través del cual pasan las gotas. En efecto, la fase móvil actúa como intermediaria transfiriendo la carga al analito. De ahí el nombre inicial que se le dio a la APCI: «electrospray mediado por eluyentes».