Guía de iniciación a la cromatografía líquida

La cromatografía líquida (LC) se definió a principios del siglo XX gracias al trabajo del botánico ruso Mikhail S. Tswett. Sus estudios pioneros se centraron en la separación de compuestos [pigmentos de las hojas], extraídos de las plantas mediante un eluyente, en una columna rellena de partículas.

Tswett llenó una columna de vidrio abierta con partículas. Dos materiales específicos que le parecieron útiles fueron la creta en polvo [carbonato de calcio] y la alúmina. Vertió su muestra [extracto eluyente de hojas de plantas homogeneizadas] en la columna y la dejó pasar al lecho de partículas. A esto le siguió el eluyente puro. A medida que la muestra pasaba por la columna por gravedad, se podían ver diferentes bandas de colores separándose porque algunos componentes se movían más rápido que otros. Relacionó estas bandas separadas de diferentes colores con los diferentes compuestos que contenía originalmente la muestra. Había creado una separación analítica de estos compuestos basada en la diferente fuerza de atracción química de cada compuesto hacia las partículas. Los compuestos que se atraían más fuertemente a las partículas se ralentizaban, mientras que otros compuestos atraídos más fuertemente por el eluyente se movían más rápido. Este proceso se puede describir de la siguiente manera: los compuestos contenidos en la muestra se distribuyen o se dividen de manera diferente entre el eluyente en movimiento, llamado fase móvil, y las partículas, llamado fase estacionaria. Esto hace que cada compuesto se mueva a una velocidad diferente, creando así una separación de los compuestos.

Tswett acuñó el nombre de cromatografía [de las palabras griegas chroma, que significa color, y graph, que significa escritura; literalmente, escritura en color] para describir su colorido experimento. [Curiosamente, el nombre ruso Tswett significa color.] En la actualidad, la cromatografía líquida, en sus diversas formas, se ha convertido en una de las herramientas más poderosas de la química analítica. 

Técnica 2.En la figura C, las muestras se colocan sobre papel [fase estacionaria]. A continuación, se añade eluyente [fase móvil] al centro de la mancha para crear un flujo radial hacia fuera. Esta es una forma de cromatografía en papel. [La cromatografía en papel clásica se realiza de forma similar a la TLC con flujo lineal.] En la imagen superior, se aplica la misma muestra de colorante FD&C negro al papel.

Hay que observar la diferencia en el poder de separación de este papel en particular en comparación con la placa TLC. El anillo verde indica que el papel no puede separar los colorantes amarillo y azul entre sí, pero podría separar esos colorantes de los colorantes rojos. En la imagen inferior, se aplica al papel una muestra verde, compuesta por los mismos colorantes amarillo y azul. Como era de esperar, el papel no puede separar los dos colorantes. En el centro, se aplicó al papel una muestra de color violeta, compuesta por colorantes rojo y azul. Están bien separados.

Técnica 3.En este método, el más potente, la muestra pasa a través de una columna o un cartucho que contiene las partículas adecuadas [fase estacionaria]. Estas partículas se denominan material de relleno cromatográfico. El eluyente [fase móvil] fluye a través del dispositivo. En la extracción en fase sólida [SPE], la muestra se carga en el cartucho y el flujo de eluyente la transporta a través del dispositivo. Al igual que en el experimento de Tswett, los compuestos de la muestra se separan después viajando a diferentes velocidades individuales a través del dispositivo. Aquí, se carga la muestra negra en un cartucho. Se utilizan diferentes eluyentes en cada paso para crear la separación.

Cuando se utiliza el formato de cartucho, hay varias formas de lograr el flujo. La gravedad o el vacío se pueden utilizar para columnas que no están diseñadas para soportar presión. Normalmente, las partículas en este caso tienen un diámetro mayor [>50 micras], por lo que hay menos resistencia al flujo. Las columnas de vidrio abiertas [experimento de Tswett] son un ejemplo de esto. Además, las pequeñas columnas de plástico, normalmente con forma de cilindro de jeringa, se pueden llenar con partículas de material de relleno y utilizarse para preparar las muestras. Esto se denomina extracción en fase sólida [SPE]. Aquí, el dispositivo cromatográfico, llamado cartucho, se utiliza, generalmente con flujo asistido por vacío, para limpiar una muestra muy compleja antes de analizarla más a fondo.

Se requieren tamaños de partículas más pequeños [<10 micrones] para mejorar el poder de separación. Sin embargo, las partículas más pequeñas tienen una mayor resistencia al flujo, por lo que se necesitan presiones más altas para crear el caudal de eluyente deseado. Se necesitan bombas y columnas diseñadas para soportar alta presión. Cuando se utiliza una presión de moderada a alta para hacer fluir el eluyente a través de la columna cromatográfica, la técnica se denomina HPLC.

¿Qué es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)?

El acrónimo HPLC, acuñado por el difunto Prof. Csaba Horváth para su artículo sobre Pittcon de 1970, indicaba originalmente el hecho de que se utilizaba alta presión para generar el flujo necesario para la cromatografía líquida en columnas rellenas. Al principio, las bombas solo tenían una capacidad de presión de 500 psi [35 bares]. Esto se denomina cromatografía líquida de alta presión o HPLC. A principios de los 70 se produjo un gran avance en la tecnología. Estos nuevos instrumentos de HPLC podían desarrollar hasta 6000 psi [400 bares] de presión e incorporaban inyectores, detectores y columnas mejorados. La HPLC realmente comenzó a afianzarse a mediados y finales de los 70. Con los continuos avances en el rendimiento durante este tiempo [partículas más pequeñas, presión aún mayor], el acrónimo HPLC siguió siendo el mismo, pero el nombre se cambió a cromatografía líquida de alta resolución.

La cromatografía líquida de alta resolución es ahora una de las herramientas más poderosas de la química analítica. Tiene la capacidad de separar, identificar y cuantificar los compuestos presentes en cualquier muestra que se pueda disolver en un líquido. Hoy en día, los compuestos en concentraciones de trazas tan bajas como partes por trillón [ppt] se pueden identificar fácilmente. La HPLC se puede aplicar y se ha aplicado a prácticamente cualquier muestra, como productos farmacéuticos, alimentarios, nutracéuticos, cosméticos, matrices ambientales, muestras forenses y productos químicos industriales.

¿Qué es la cromatografía líquida de ultra-alta resolución (tecnología UPLC)?

En 2004, se produjeron nuevos avances en los instrumentos y la tecnología de las columnas para lograr aumentos muy significativos en la resolución, la velocidad y la sensibilidad de la cromatografía líquida. Se necesitaron columnas con partículas más pequeñas [1,7 micras] e instrumentos con capacidades especializadas diseñados para suministrar la fase móvil a 15 000 psi [1000 bares] para alcanzar un nuevo nivel de rendimiento. Se tuvo que crear un nuevo sistema de manera integral para realizar la cromatografía líquida de ultra-alta resolución, ahora conocida como tecnología UPLC.

En la actualidad, científicos que trabajan con columnas que contienen partículas aún más pequeñas de 1 micra de diámetro están realizando investigaciones básicas e instrumentos capaces de funcionar a 100 000 psi [6800 bares]. Esto proporciona una idea de lo que podemos esperar en el futuro.