Caracterizar los espectros producidos por desorción e ionización suave
Las reacciones retro Diehls-Alder y las energías hemolíticas/heterolíticas necesarias para disociar o escindir los enlaces que conducen a una fragmentación específica bien caracterizada siguen siendo la base de nuestro pensamiento cuando nos enfrentamos a los espectros de masas. La parte difícil de la EM es a menudo responder a la pregunta planteada por Fred W. McLafferty, uno de los contribuyentes importantes a nuestra comprensión de las reglas de interpretación: «¿Cuál es la masa con la que estamos tratando?»
Hasta el desarrollo de técnicas de desorción como la de ionización por desorción con láser asistida por matriz (MALDI) y la de electrospray, esa pregunta al menos en ocasiones parecía más fácil de responder. La facilidad dependía de si la muestra tenía que derivatizarse para hacerla volátil y apta para la GC-MS. Aquí, a menudo, los espectros estarían dominados por los grupos derivatizados y mostrarían poco o ningún ion molecular (de ahí la necesidad de CI). En ese caso, la llegada de electrospray y APCI contribuyó sin duda a la identificación del peso molecular de las especies de moléculas pequeñas con carga simple. Al menos en esos casos, la MS se ocupa del valor m/z de los iones que muestran una sola carga. La masa de un analito generalmente se notificaba como la masa nominal (el valor nominal m/z) del ion molecular, lo mismo que la masa nominal de la molécula. La masa nominal de un ion, molécula o radical es la suma de las masas nominales de los elementos en su composición elemental. La masa nominal de un elemento es la masa entera del isótopo estable más abundante de origen natural.
Pero la respuesta se volvió más elusiva cuando las técnicas de desorción por ionización suave como la ionización por electrospray (ESI) se generalizaron comercialmente a principios de la década de 1990. En la era de “predesorción” de la MS, la masa nominal de la mayoría de los analitos examinados por la MS era inferior a 500 Da. El defecto de masa debido a la presencia de hidrógeno no fue un problema para estos analitos. El límite superior de m/z para la mayoría de los espectrómetros de masas se encontraba en el intervalo de 650-800. Así, en esos días de ionización previos a la desorción, la masa nominal y la masa monoisotópica entera eran del mismo valor. La masa monoisotópica de un ion, molécula o radical es la suma de las masas monoisotópicas de los elementos en su composición elemental. La masa monoisotópica de un elemento es la masa exacta del isótopo estable más abundante de origen natural.
Al inicio de la era de la ionización por desorción, las moléculas más grandes y una mayor precisión se convirtieron en parte integral de los estudios porque la tecnología lo permitía con poca dificultad. Solo entonces el problema del defecto de masa se volvió tan importante. En un espectrómetro de masas capaz de notificar solo el valor entero más cercano de m/z, el ion molecular de un compuesto C50H102 podría representarse por un pico a m/z 703 en lugar de a m/z 702, porque el ion molecular tendría un efecto monoisotópico de 702,7825, que se redondea al número entero 703.
Por encima de 500 Da, el defecto de masa puede ser un problema grave para determinar los valores m/z de los picos de MS. Es importante tener en cuenta que el espectrómetro de masas mide las intensidades de las señales que se producen en un momento específico durante la recogida del espectro de masas, independientemente del tipo de analizador m/z utilizado. El valor m/z indicado es una función del tiempo que los iones de un valor m/z conocido producidos por un compuesto específico (en relación con el compuesto de calibración) llegan al detector.
Debido a que la masa de los iones monoisotópicos cambia a medida que cambia la posición en la escala m/z, el espectrómetro de masas que notifica valores m/z enteros puede realizar mediciones cada 0,05 m/z unidades. La intensidad detectada puede ser la del máximo del pico del espectro de masas o la suma de las intensidades a lo largo del pico del espectro de masas. El valor m/z indicado es un número entero obtenido redondeando el valor m/z observado para el máximo del pico del espectro de masas.
La MS por ionización por impacto electrónico a menudo se basa en compuestos perfluorados como la perfluorotributilamina (masa molecular nominal de 671) para calibrar la escala m/z. Esto se debe a que la masa entera de un ion es casi la misma que su masa monoisotópica. Una vez que un ion supera una masa nominal de 1000 Da, no se observa ningún pico de valor m/z nominal en el espectro de masas. El pico de masa monoisotópico se desplaza desde donde debe observarse el pico de masa nominal en una cantidad igual al defecto de masa del ion. Para iones de carga única con masas superiores a 500 Da, utilizando técnicas como electrospray con cuadrupolo de transmisión o los espectrómetros de masas con captura de iones de cuadrupolo que tienen una resolución unitaria en toda la escala m/z, los picos de isótopos se separarán claramente.
De las numerosas discusiones sobre el papel que desempeñan los isótopos en la determinación de la identidad de un compuesto, apareció una en LCGC Europe que aporta un balance útil. “Interpretation of Isotope Peaks in Small Molecule LC – MS” (L.M. Hill, LCGC Europe 19 (4), 226–238 (2006) se basa en el trabajo de captura de iones de baja resolución. En una parte relevante, el autor advierte contra el exceso de confianza cuando se utilizan capturas de iones: “Los usuarios de capturas deberán tener más cuidado que aquellos con sistemas QTOF o de triple cuadrupolo. Obviamente, es necesario comenzar con el pico del isótopo +1 aislado libre de contaminación... las capturas de iones tienden a capturar con una resolución más baja de la que escanean... vaciar la captura... en orden de masa». Esto no significa que las capturas de iones no puedan utilizarse, pero, como todos los instrumentos, deben aplicarse con conocimiento de sus capacidades y limitaciones.
Del mismo modo, un instrumento con una resolución muy alta no confiere automáticamente la respuesta correcta. El conjunto de datos presentado en un artículo de Kind y Fiehn —T. Kind y O. Fiehn, BMC Bioinformatics 7, 234 (2006)— es particularmente sorprendente y los condujo a su conclusión, que basaron en el examen de 1,6 millones de resultados de búsqueda de fórmulas: “La alta exactitud de masa (1 ppm) y la alta potencia de resolución por sí solos no [son] suficientes... solo un filtro de patrón de abundancia isotópica [es] capaz de reducir el número de candidatos a fórmulas moleculares». Los espectrómetros de masas con una exactitud de masa de solo 3 ppm, pero una exactitud del patrón de isótopos del 2 %, suelen eliminar más del 95 % de los candidatos falsos. Este rendimiento superaría incluso a los espectrómetros de masas con capacidad de 0,1 ppm (si dichos instrumentos realmente existieran) que no están equipados con la capacidad de generar patrones isotópicos.
Entre masas de 150 Da y 900 Da, el número de fórmulas posibles enumeradas como exactitud de masa aumentó de 10 ppm a 0,1 ppm sin la ayuda de la información de abundancia de isótopos: de un mínimo de 2 fórmulas candidatas a 150 Da a 3447 a 900 Da para 10 ppm. Incluso en el extremo superior (900 Da), la exactitud de masa sola a 1 ppm produce 345 candidatos. Al invocar una exactitud de abundancia de isótopos del 2 %, el número de candidatos a 900 Da se reduce a 18. También muestran que, si se permite una exactitud insignificante del 5 % para la adquisición de isótopos asociada con una exactitud de 5 ppm, se obtienen 196 candidatos.
