Cromatografía de líquidos preparativa

1. Aislamiento de antioxidantes con el sistema Prep 150 LC.
2. Aislamiento de péptidos con el sistema Prep 150 LC.
3. Purificación de cannabinoides del aceite de cáñamo con el sistema Prep150 LC.
4. Aislamiento de flavonoides de hojas de Gingko Biloba con el sistema Prep 150 LC de Waters.
5. Obtención de un producto natural del extracto de Echinacea mediante el Sistema Prep 150 LC.
6. Optimización del aislamiento de compuestos de forma automática con UPLC combinada con cromatografía preparativa mediante purificación automática dirigida por masas.
7. Purificación dirigida por masas de un péptido sintético con el detector ACQUITY QDa.
8. Estrategias para mejorar el aislamiento mediante el desarrollo de métodos de preparación para grandes volúmenes y métodos sencillos en la cromatografía preparativa.
9. Técnicas para mejorar la eficacia de la carga de grandes volúmenes en la cromatografía de líquidos preparativa.
10. Purificación dirigida por masas de compuestos Sulfa procedentes de una mezcla de antibióticos con un detector ACQUITY QDa.
11. Purificación dirigida por masas de un compuesto farmacéutico mediante AutoPurify con un detector ACQUITY QDa.
12. Condiciones habituales para analizar y aislar los componentes de la mezcla estándar de patrones para cromatografía preparativa con un detector ACQUITY QDa.
13. Cromatografía preparativa de extractos de productos naturales utilizando una estrategia de purificación de Open access basada en UV.
14. Un sistema Prep HPLC modular para el aislamiento de Puerarin a partir de extractos de raíz de Kudzu.
15. Mejora sistemática en la resolución y la carga de la columna en la cromatografía líquida preparativa para aislar un componente minoritario de un extracto de menta.
16. Aislamiento de péptidos e impurezas a pequeña escala con los sistemas ACQUITY UPLC H-Class y Waters Fraction Manager-Analytical.
17. Purificación a pequeña escala de constituyentes a partir de extractos de productos naturales complejos utilizando sistemas ACQUITY H-Class y Waters Fraction Manager- Analytical.
18. At-Column-Dilution, Application Notes, Revision A, Waters Corp, 2003. Para obtener más información sobre las notas de aplicación útiles y las referencias, visitar www.waters.com e introducir los números de referencia azules en el cuadro de búsqueda. 

CONCLUSIÓN: 

• Dilución en la columna: técnica de inyección patentada que aumenta la capacidad de masa, mejora la resolución, aumenta la vida útil de la columna y mejora la robustez del sistema de LC al diluir la muestra en un eluyente fuerte en la cabeza de la columna. Cromatograma: una representación gráfica o de otro tipo de la respuesta del detector u otra cantidad utilizada como medida de la concentración del analito en el eluyente frente a su volumen o tiempo. Volumen de la columna (V_c), V_c = π x (r) ² × Altura × 66 % disponible para la fase móvil/1000 para convertir mm³ a mL - El volumen geométrico de la parte del tubo que contiene el relleno (área de sección transversal interna del tubo multiplicado por la longitud del lecho de relleno, L con compensación del espacio ocupado por el material de relleno, 66 %), en una pequeña parte del flujo al detector, mientras que la parte principal va a las separaciones del colector de fracciones. El volumen de permanencia todavía existe, pero, debido a que la concentración de la fase móvil es constante, no se observan diferencias entre los cromatogramas analizados en diferentes sistemas de volumen de permanencia. Eluato, eluyente, eluir: el eluato hace referencia a la parte del eluyente que sale o eluye de la salida de la columna que contiene los analitos en solución. En la HPLC analítica, el detector examina el eluato para determinar la concentración o masa de analitos que contiene. En la HPLC preparativa, el eluato se recoge continuamente en alícuotas a intervalos de tiempo o volumen uniformes, o de forma discontinua solo cuando el detector indica la presencia de un pico de interés. Estas fracciones se procesan posteriormente para obtener compuestos purificados. Hidrofóbico: cualidad que poseen los radicales o moléculas no polares que son más solubles en los eluyentes orgánicos que en el agua. Cromatografía de intercambio iónico: la cromatografía de intercambio iónico (o cromatografía iónica) es un proceso cromatográfico que separa los iones y las moléculas polares en función de su afinidad con el intercambiador de iones. La técnica de separación se utiliza para cualquier tipo de molécula cargada, como proteínas grandes, nucleótidos pequeños y aminoácidos. Isocrático: la composición de la fase móvil permanece constante durante el transcurso de una separación cromatográfica. Eluyente auxiliar: eluyente que se utiliza para diluir y transferir la muestra separada del flujo de preparación a los detectores en un sistema de purificación dirigido por masas. Fase móvil: eluyentes utilizados para eluir compuestos de una columna de HPLC. Caudal: volumen de fase móvil que pasa a través de una columna en una unidad de tiempo. Inyector (inyector automático, sistema de gestión de muestras): mecanismo para introducir (inyectar) de forma exacta y precisa un volumen predeterminado de una solución de muestra en el flujo de fase móvil. Elución isocrática: la composición de la fase móvil permanece constante durante el proceso de elución. Fase móvil: fluido que se mueve, en una dirección definida, a lo largo del lecho sorbente de la fase estacionaria. Pico: registro de la respuesta del detector mientras se eluye un solo componente de la columna. Resolución (Rs): la separación de dos picos, expresada como la diferencia entre sus respectivos tiempos de retención, dividida por la anchura media de pico en la línea base. Rs = 1,25 indica que dos picos de igual anchura están separados en la línea base. Cuando Rs = 0,6, la única indicación visual de la presencia de dos picos en un cromatograma es una pequeña muesca cerca del máximo del pico. Tiempo de retención (RT): tiempo entre el inicio de la inyección o la introducción de la muestra y la aparición del máximo del pico. Selectividad: término utilizado para describir la magnitud de la diferencia entre las afinidades relativas de un par de analitos para la fase móvil y estacionaria especificadas que componen el sistema de cromatografía. Escalado: la cantidad de producto aislado purificado deseado por aislamiento determina la escala, el diámetro de la columna y los requisitos del sistema y de hardware. La cantidad puede variar desde el aislamiento o purificación de pequeñas cantidades de µg de enzimas hasta las grandes cantidades de kg necesarias para la fabricación de fármacos industriales. El escalado es la generación de mayores cantidades de un compuesto en particular para una evaluación adicional tras la demostración inicial del valor potencial. Gradiente escalonado: método de separación que mantiene la pendiente antes y después de una parte con poca pendiente y enfocada del gradiente, preservando así el perfil cromatográfico de estas partes de la separación, que a menudo se utilizan para determinar el volumen de permanencia del sistema. Silanol: grupo químico unido al material de relleno de la columna de sustrato de sílice disponible que interacciona con la muestra. Divisor: se utiliza para desviar una pequeña parte del flujo de muestra a un detector destructivo, como en la purificación con espectrometría de masas. Fase estacionaria: un sólido poroso (p. ej., vidrio, sílice o alúmina) que se introduce en un tubo de vidrio o metal o que constituye las paredes de un capilar de tubo abierto. La fase móvil fluye a través del lecho relleno o la columna, la muestra que se va a separar se inyecta al principio de la columna y se transporta a través del sistema por la fase móvil. Diferentes sustancias se distribuyen según su afinidad relativa para las dos fases. Rendimiento: ventaja de trabajar con separaciones de LC a velocidades lineales más altas utilizando columnas analíticas de menor volumen y de partículas más pequeñas, o columnas preparativas de gran volumen para partículas grandes. Una mayor resolución, una mayor velocidad y una mayor eficacia suelen proporcionar un mayor rendimiento. Se pueden purificar cantidades mayores de compuesto por análisis o período de proceso.

GLOSARIO

1. Volumen del sistema: volumen de permanencia, volumen de retardo, volumen del sistema desde el punto en el que se mezclan los eluyentes de la fase móvil hasta que alcanzan la cabeza de la columna. Para los sistemas de LC de mezcla a alta presión, esto comprende el mezclador, el tubo de conexión y el bucle del inyector automático como componentes principales, de importancia práctica solo para las aplicaciones de gradiente.
2. Proporción de división: cantidad de material que se «extrae» y se diluye continuamente del flujo de muestra antes de transferirlo a los detectores durante la purificación dirigida por masas.
3. Cromatografía de exclusión por tamaño: separación cromatográfica de compuestos en función de su tamaño en solución.
4. Gradiente suave: gradiente en el que la velocidad de cambio de la concentración de eluyente orgánico por volumen de columna es lenta, que se utiliza para separar compuestos con una afinidad similar por la matriz de la columna.
5. Gradiente segmentado: método de separación que incluye varios gradientes con diferentes pendientes para separar varios compuestos con diferente selectividad y con el mayor rendimiento.
6. Sensibilidad (S): la señal de salida por unidad de concentración o unidad de masa de una sustancia en la fase móvil que entra en el detector. Para los detectores sensibles al flujo másico, es la relación entre la altura del pico y la masa unitaria.
7. Cromatografía de fase reversa: procedimiento de elución utilizado en cromatografía líquida en el que la fase móvil es significativamente más polar que la fase estacionaria.
8. Factor de retención (k): una medida del tiempo que el componente de la muestra permanece en la fase estacionaria en relación con el tiempo que permanece en la fase móvil. Expresa cuánto tiempo más retarda la fase estacionaria un componente de la muestra de lo que tardaría en viajar a través de la columna con la velocidad de la fase móvil.
9. Cromatografía preparativa: el proceso de utilizar cromatografía líquida para aislar un compuesto en una cantidad y con un nivel de pureza suficientes para experimentos o usos posteriores.
10. Divisor pasivo: dispositivo que se utiliza para muestrear continuamente el flujo principal o la corriente de preparación con una proporción de división definida. Gestiona la señal del detector en la purificación dirigida por masas.
11. Cromatografía de líquidos (LC): una técnica de separación en la que la fase móvil es un líquido.
12. Entrada: el extremo del lecho de la columna donde entran el flujo de la fase móvil y la muestra.
13. Gradiente: el cambio con el tiempo en las concentraciones relativas de dos (o más) componentes eluyentes miscibles que forman una fase móvil de fuerza de elución creciente.
14. Modificador de fase móvil: aditivos mezclados con los eluyentes cromatográficos para mejorar la separación.
15. Capacidad de masa: también llamada «carga de masa». Cantidad máxima de material que se puede inyectar en una columna y la resolución del compuesto de interés se mantiene adecuadamente.
16. Gradiente lineal: método de separación cromatográfica que cambia la composición de la fase móvil a una velocidad constante durante un período de tiempo definido.
17. Ionización: proceso por el cual una molécula adquiere una carga negativa o positiva al ganar o perder electrones para formar iones.
18. Hidrofílico: se disuelve o interactúa fácilmente con el agua o los eluyentes polares debido a la presencia de grupos polares fuertes.
19. Equilibrado: para los métodos cromatográficos en los que se emplea un gradiente, es necesario un tiempo de equilibrado posterior al análisis para que la columna y el sistema vuelvan a las condiciones iniciales de la fase móvil antes de la siguiente inyección. Para lograr un equilibrio adecuado, la columna debe lavarse 5 veces el volumen total de la columna (CV), más 3 veces el volumen del sistema (permanencia) en las condiciones iniciales del método. Gradient Chromatography Column Re-Equilibration, Performance Perspectives, Waters Corp. 1998. Pendiente de gradiente: velocidad de cambio en la composición de eluyentes orgánicos por volumen de columna durante una separación en gradiente.
20. Eficacia: medida de la capacidad de una columna para resistir la dispersión de una banda de muestra a medida que atraviesa el lecho de relleno. Una columna eficiente minimiza la dispersión de banda o su ensanchamiento. Una mayor eficacia es importante para una separación eficaz, una mayor sensibilidad o identificación de componentes similares en una combinación de muestras compleja.
21. Volumen de permanencia: volumen del sistema desde el punto en el que se mezclan los eluyentes de la fase móvil hasta que alcanzan la cabeza de la columna. Para los sistemas de LC de mezcla a alta presión, comprende el mezclador, el tubo de conexión y el bucle del inyector automático como componentes principales; cuando los componentes de la fase móvil se mezclan en línea para isocrático.
22. Detector: dispositivo que indica un cambio en la composición del eluyente mediante la medición de propiedades físicas o químicas (p. ej., absorbancia de luz UV/visible, índice de refracción diferencial, fluorescencia o conductividad). Algunos detectores (p. ej., electroquímicos, espectrómetros de masas) son destructivos; es decir, producen un cambio químico en los componentes de la muestra. Si un detector es destructivo para la muestra, se utiliza un divisor para desviarla.
23. Cromatografía: método de separación en el que los componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (la fase estacionaria), mientras que la otra (la fase móvil) se mueve con respecto a la fase estacionaria.
24. Cromóforo: parte de una molécula que absorbe ciertas longitudes de onda de luz visible y transmite o refleja otras. El cromóforo es una región de la molécula en la que la diferencia de energía entre dos orbitales moleculares diferentes está dentro del intervalo del espectro visible. Por tanto, la luz visible que incide en el cromóforo se puede absorber excitando un electrón de su estado fundamental a un estado excitado.

REFERENCIAS

• La cromatografía preparativa se ha convertido en una valiosa técnica para la fabricación de productos farmacéuticos, el aislamiento de productos naturales y otras operaciones importantes en las que se requiere la generación de material purificado. La clave para utilizar la técnica al máximo es directamente proporcional a la calidad del desarrollo del método. Una vez que se ha equipado un sistema de purificación con el hardware y el software adecuados para la purificación a gran escala, la transferencia de métodos de pequeña escala a gran escala se convierte en rutina. 
  • Sarker, S., Latif, Z., Gray, A., “Natural Products Isolation” Second Edition. Humana Press. 2006.
  • Aubin, A. "UV-Directed Purification of a Small-Scale Organic Synthesis," Waters Corporation, Milford, MA USA. 2008.
  • Diehl, D. Fountain, K. Wheat, T. Joblonski, J. Yin, Z. Morrison, D; Collier, S. Murphy, B. Cleary, R. Compagnon, L., "Practical Chemistry Considerations for Purification." Waters Presentation. 2008.
  • Dolan, J. “A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection.” Advanced Chromatography Technologies. www.ace-HPLC.com.
  • Jablonski, J et. al. “Effective Use of Temperature Control in Compound Isolation.” Waters Corporation, Milford, MA EE. UU.
  • "At-Column-Dilution, Application Notes", Waters Corp, 2003.
  • Para obtener más información sobre las notas de aplicación útiles y las referencias, visitar www.waters.com e introducir los números de referencia azules en el cuadro de búsqueda.