Cromatografía de líquidos preparativa

Aunque las separaciones complejas se ven más afectadas por la selectividad del material de relleno de la columna, cuando se desarrolla un método de separación dirigido a la purificación es más eficiente comenzar con la optimización de la separación de muestras generada con un gradiente de exploración rápido. El objetivo de los gradientes de exploración es determinar la concentración aproximada de eluyente necesaria para eluir los compuestos de interés de la columna. Los gradientes de exploración suelen comenzar a partir de la misma concentración de eluyente fuerte (2-10 %) y aumentan linealmente hasta el 25 %, 75 %, 50 % y 90-95 %.

Una vez finalizados los gradientes de exploración, los resultados se revisan y evalúan mediante una serie de preguntas antes de pasar al siguiente paso:

• ¿El gradiente de exploración rápido proporciona una separación adecuada para el compuesto de interés?
• ¿El gradiente de exploración rápido es adecuado para la velocidad o la eficacia?
• ¿Se puede mantener la separación del compuesto de interés de otros picos a la carga de muestra requerida?

Si el gradiente de exploración no da un resultado adecuado, se puede optimizar mediante el enfoque del método o, como alternativa, se puede modificar la separación por completo a través del pH, eluyente u otras variables cromatográficas.

Optimizar el método

El análisis de exploración que proporciona la mayor resolución para el compuesto de interés se puede optimizar modificando la composición de los eluyentes fuertes y débiles. La composición puede permanecer constante (isocrática) o puede cambiar por una unidad de tiempo o volumen de columna determinados (gradiente).

Elución isocrática

En una separación isocrática, el eluyente débil y el fuerte se mantienen en una proporción invariable por unidad de tiempo. El analista puede preparar el eluyente isocrático fuera de línea o mezclarlo en línea con una bomba de HPLC capaz de dosificar los diferentes eluyentes a una velocidad predeterminada constante. Este modo de elución es cómodo, uniforme y robusto porque las influencias del tiempo de retención provocadas por el volumen de permanencia son insignificantes cuando se transfiere un método entre sistemas.

La elución isocrática tiene inconvenientes y puede no ser adecuada para todas las separaciones. Hay problemas inherentes que incluyen una resolución deficiente de los picos de elución temprana, una disminución de la simetría debido a picos con cola, una disminución de la sensibilidad debido al ensanchamiento de banda y problemas de contaminación de la columna debido a la acumulación de compuestos fuertemente retenidos.

Elución en gradiente

Las separaciones en gradiente en fase reversa o intercambio iónico suelen implicar la mezcla en línea de la fase móvil para lograr un aumento constante del eluyente orgánico a lo largo del análisis. Al comienzo del gradiente, cuando la concentración del eluyente es baja, el analito se divide en la fase estacionaria o permanece en la cabeza de la columna. A medida que aumenta la concentración del eluyente, el analito se transfiere a la fase móvil, se mueve por la columna y, finalmente, se eluye.

La elución en gradiente proporciona la capacidad de separar analitos con un amplio intervalo de hidrofobicidad en un período de tiempo razonable. Las ventajas adicionales pueden incluir una mejor resolución de los picos y una mayor sensibilidad debido a una mayor altura de los picos. El deterioro de la columna también se reduce cuando los componentes fuertemente retenidos se eliminan de la columna al final del análisis.

También hay desventajas cuando se utiliza la elución en gradiente. Se requiere una mezcla de gradiente en línea constante y sin pulsos, por lo que a menudo se necesita una costosa instrumentación como bomba. Además, puede producirse precipitación cuando algunas fases móviles se mezclan en determinadas combinaciones. Los tiempos de análisis pueden ser largos debido al reequilibrado posterior al gradiente, y el tiempo de permanencia (Vd) de los instrumentos puede variar, lo que causa problemas de transferencia de métodos, sin una compensación adecuada.

Gradiente lineal

Los gradientes lineales progresan con un aumento constante de la composición del eluyente fuerte durante todo el análisis. A menudo se utilizan en experimentos de cribado rápido para determinar rápidamente la relación de eluyentes que eluye el pico de interés y para mantener el tiempo de análisis considerablemente corto, por lo que se obtiene una elución en menos tiempo y con un coste de eluyente reducido.

Gradiente segmentado

Un gradiente segmentado es la combinación de una serie de gradientes lineales, cada uno con una pendiente o inclinación diferentes. Los segmentos con poca pendiente resuelven los compuestos de interés, mientras que los segmentos empinados son áreas del cromatograma en las que no se requiere una alta resolución, como en un lavado posterior a la separación.

Los gradientes enfocados suelen ser más cortos y exagerados que los gradientes segmentados. Por lo general, la fuerza del eluyente es muy baja inmediatamente después de la inyección. A continuación, se aumenta rápidamente entre un 2 % y un 5 % por debajo de la relación de eluyentes necesaria para la elución del compuesto de interés (es decir, concentración de elución del 22 % – 2 % = 20 % del gradiente superficial inicial). Después, se aplica un gradiente superficial a aproximadamente 1/5 de la pendiente determinada en la separación de exploración rápida para terminar finalmente en entre un 2 % y un 5 % por encima de la concentración de elución del compuesto de interés (es decir, 22 % + 2 % = 24 % de detención del gradiente superficial). Por último, el porcentaje de eluyente se aumenta rápidamente para lavar la columna de cualquier componente de muestra restante.

Desarrollar un gradiente enfocado

Los siguientes cálculos se pueden utilizar para generar un gradiente enfocado para el compuesto de interés después de que la muestra se haya analizado con un gradiente de exploración rápido. Cada ecuación va seguida de un ejemplo teórico.

En primer lugar, se debe determinar el volumen de permanencia del sistema para el instrumento que se utilizó para el análisis del gradiente de exploración. Las instrucciones para la determinación del volumen de permanencia se pueden encontrar en la sección de este manual titulada «Determinación del volumen de permanencia» o en la herramienta de aplicación «Analytical to Prep Gradient Calculator» (Calculadora de gradiente de analítica a preparativa) en www.waters.com/prepcalculator.

Además, también se debe determinar el volumen de la columna utilizada para el análisis de exploración. Se puede calcular utilizando el volumen de un cilindro V = πr²h y compensando el volumen ocupado por el material de relleno, es decir, V = πr²h (66 %). También se puede utilizar la herramienta de aplicación «Analytical to Prep Gradient Calculator» (Calculadora de gradiente de analítica a preparativa) para realizar este cálculo.

Ecuación 1: Volumen de la columna

Volumen de la columna = π r² x Altura x 66 % disponible para la fase móvil/1000 para convertir mm³ a mL

Ejemplo:

CV = 3,14 x (4,6 mm/2)² x 50 mm x 0,66/1000
CV = 548 mm³ = 0,548 mL

Ecuación 2: Volumen de ajuste entre la formación del gradiente y el detector

Volumen de ajuste = Volumen del sistema* + Volumen de la columna
* Volumen del sistema o volumen de ajuste

Ejemplo:

Volumen de ajuste = 1,04 mL + 0,548 mL
Volumen de ajuste = 1,588 mL

Ecuación 3: Tiempo hasta el detector

Tiempo hasta el detector = Compensación en mL/Caudal en mL/min

Ejemplo:

Tiempo hasta el detector = 1,588 mL/1,5 mL/min
Tiempo hasta el detector = 1,06 min

Ecuación 4: Tiempo en el que se formó la concentración de elución

Tiempo de elución de la concentración = Tiempo de retención del pico de interés - Tiempo hasta el detector - Retención del gradiente

Ejemplo:

Tiempo de concentración de elución = 6,0 min - 1,06 min - 0,0 min
Tiempo de concentración de elución = 4,94 min

Ecuación 5: Concentración porcentual de elución

% de concentración de elución = Tiempo de concentración de elución/Longitud del segmento del gradiente de exploración x Cambio de exploración + % de gradiente de exploración inicial

Ejemplo:

% de concentración de elución = 4,94 min/6,0 min x 90 % + 5 %
% de concentración de elución = 79,1 %

Ecuación 6: Número de volúmenes de columna (CV)

Núm. de volúmenes de columna = 1 volumen de columna/mL x mL/min del flujo x Longitud del segmento de gradiente de exploración

Ejemplo:

Núm. de CV = 1 CV/0,548 mL x 1,5 mL/min x 6 min
Núm. de CV = 16,4

Ecuación 7: Pendiente del gradiente de exploración

Pendiente del gradiente de exploración = % de cambio del gradiente de exploración/Núm. de volúmenes de columna

Ejemplo:

Pendiente del gradiente de exploración = (95 -5 %)/16,4 CV Pendiente del gradiente de exploración = 5,49 %/CV

Ecuación 8: Pendiente del gradiente enfocado

Pendiente del gradiente enfocado = 1/5 x pendiente del gradiente de exploración

Ejemplo:

Pendiente del gradiente enfocado = 1/5 x 5,49 % CV Pendiente del gradiente enfocado = 1,1 %/CV

El segmento de gradiente enfocado se crea desde un 5 % por debajo hasta un 3-5 % por encima del porcentaje de elución estimado. Como ejemplo, el porcentaje de elución es del 79 %.

Ecuación 9: Duración del segmento del gradiente enfocado

Duración del segmento de gradiente enfocado = % del intervalo x (1/pendiente del gradiente de exploración) x volumen de la columna x (1/caudal)

Ejemplo:

Duración del segmento de gradiente enfocado = (79 % + 5 %) - (79 % - 5 %) x (1/1,1 %) x (0,548 mL) x (1/1,5 mL/min)
Duración del segmento de gradiente enfocado = 3,32 min

El último paso es escribir el gradiente enfocado utilizando los valores calculados en las fórmulas anteriores.