Cromatografía de líquidos preparativa

Cuando hay una demostración inicial del valor potencial de un producto aislado, se puede «escalar» un método de separación para generar cada vez más cantidades de dicho aislamiento y, así, realizar una evaluación adicional. Los atributos de separación a pequeña escala, como la resolución, se pueden mantener fácilmente a gran escala. El caudal, la carga de muestra y el hardware del sistema deben modificarse para transferir eficazmente la separación a columnas de mayor capacidad mediante fórmulas matemáticas definidas.

La primera etapa del escalado normalmente abarcará la producción de cantidades de mg a gramo de producto aislado para diversos usos que van desde la evaluación biológica temprana hasta el establecimiento de relaciones estructura-actividad para productos análogos con propiedades terapéuticas mejoradas. Las etapas posteriores del escalado implican cantidades de material desde 100 g a varios kilogramos y más para el desarrollo preclínico y clínico, que, si tiene éxito, culminará en última instancia en la fabricación a escala completa. A esta escala, entran en juego la documentación y los controles de calidad, como las Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP).

El flujo de trabajo de escalado es un proceso por pasos. Los cálculos de escalado deben realizarse con exactitud. De lo contrario, es posible que el resultado final no proporcione la resolución lograda en la separación a pequeña escala. Para aumentar el éxito del escalado de métodos y para mantener el tiempo de retención y la selectividad, se deben considerar detenidamente varios requisitos:

• Se debe utilizar una fase móvil idéntica a pequeña y a gran escala.
• Las columnas con una composición química, una longitud y un tamaño de partícula idénticos facilitan el escalado (como alternativa, se puede cambiar el tamaño de las partículas siempre que se mantenga la relación L/dp entre la longitud de la columna y el tamaño de las partículas del método inicial).
• Las muestras deben prepararse a la misma concentración, en el mismo diluyente.

Determinación del volumen de permanencia

El volumen de permanencia (volumen de retardo, volumen del sistema) es importante para preservar la resolución de los picos de elución temprana al aumentar la escala o cambiar de sistema. Se define como el volumen desde el punto de formación del gradiente hasta la cabeza de la columna. Para los sistemas de LC de mezcla a alta presión, este volumen comprende principalmente el mezclador, el tubo de conexión y el bucle del inyector automático. Los sistemas de mezcla de baja presión combinan los eluyentes antes de la bomba, por lo que los tubos adicionales más el volumen del cabezal (o cabezales) de la bomba más el mezclador, el tubo de conexión y el bucle del inyector automático contribuyen al volumen de permanencia total.

Cuando los componentes de la fase móvil se mezclan en línea para las separaciones isocráticas, el volumen de permanencia todavía existe, pero como la concentración de la fase móvil es constante, no se observan diferencias en la cromatografía. Por otro lado, los métodos de gradiente se basan en un cambio en la concentración de la fase móvil a lo largo del tiempo para generar la separación de los picos. La compensación del volumen de permanencia en un método de gradiente garantiza que se mantengan los tiempos de retención de los picos, lo que es especialmente importante cuando se desea recoger fracciones purificadas.

Para determinar el volumen de permanencia, se puede utilizar un gradiente escalonado de los eluyentes de la fase móvil A y de la fase móvil B que contengan un aditivo con diferente absorción de UV (p. ej., 0,05 mg/mL de uracilo o 0,2 % de acetona en acetonitrilo) según el método indicado en www.waters.com/prepcalculator en «Analytical to Prep Gradient Calculator».

Capacidad

En la cromatografía de purificación, el objetivo principal es mantener una resolución adecuada para el compuesto que se va a recoger. La capacidad o carga de la columna se mide mediante la resolución del compuesto y los picos adyacentes. Aunque la capacidad de la columna está influenciada principalmente por su longitud y diámetro, pueden contribuir otros factores, como la solubilidad y la complejidad de la combinación de muestras. Las tendencias de capacidad son las siguientes:

• La capacidad depende principalmente de la solubilidad de la muestra en particular.
• La capacidad es mayor para mezclas simples.
• La capacidad es menor cuando se requiere una alta resolución.
• La capacidad depende de las condiciones de carga.

La capacidad para un compuesto de interés específico se determina antes del escalado del método a través de estudios de carga. Estos estudios se realizan a pequeña escala y se ejecutan mediante una de las siguientes técnicas: se prepara una muestra a una concentración alta y el volumen de inyección se aumenta gradualmente, o se prepara una muestra a diferentes concentraciones y el volumen de inyección se mantiene constante. Para cualquiera de las técnicas, el objetivo es determinar la concentración máxima o el volumen de inyección que mantiene la resolución adecuada del compuesto de interés de las impurezas circundantes. Una vez que se determina la capacidad de la columna, se puede escalar utilizando una fórmula para columnas y flujos de trabajo de mayor diámetro.

Ecuación 10: Escalado de la carga de concentración

Por lo tanto, para escalar una carga de 1800 µg (1,8 mg) en una columna analítica de 4,6 mm × 50 mm a la carga equivalente en una columna preparativa de 19 mm × 50 mm:

Ecuación 11: Escalado del volumen de inyección

Para escalar una carga de volumen de inyección de 20 µL:

Dilución en la columna

Los eluyentes fuertes como el DMSO pueden mejorar la solubilidad de la muestra, lo que puede aumentar la capacidad de la columna. Desafortunadamente, los grandes volúmenes de inyección de los eluyentes fuertes pueden distorsionar la cromatografía, lo que da como resultado una reducción en lugar de un aumento en la cantidad de producto que se puede aislar con éxito.

La distorsión se produce cuando se transporta un eluyente fuerte desde el inyector hasta la cabeza de la columna como un tapón intercalado en una corriente de eluyente acuoso. La precipitación de la muestra puede ocurrir en los bordes del tapón donde el eluyente de muestra fuerte se diluye con el eluyente acuoso. Esta precipitación puede ocasionar un bloqueo en la trayectoria del fluido y provocar el apagado del sistema de alta presión.

Si la precipitación no provoca el apagado del sistema, la muestra entra en la columna, pero no hay retención hasta que el bolo de muestra se diluye con la fase móvil. Con inyecciones más grandes, el volumen necesario para diluir la muestra solo puede obtenerse moviendo el tapón una distancia considerable por la columna. En estos casos, la muestra se deposita como una banda ancha que ocupa una gran fracción del volumen de la columna. El resultado es una resolución incompleta de los picos repartidos en los grandes volúmenes de eluyente. Esta situación puede reducirse limitando estrictamente tanto el volumen como la masa de muestra inyectada.

La alternativa es una dilución considerable de la muestra con agua o con un eluyente suave para asegurar una retención adecuada.

Ninguno de los dos enfoques es completamente satisfactorio, ya que el rendimiento y la recuperación se ven comprometidos. Como alternativa, en un sistema de dilución en la columna, el sistema se reconfigura para que el bolo de muestra llegue a la entrada de la columna, donde se diluye continuamente con una corriente de diluyente acuoso. La velocidad de transferencia a la columna es tan alta que no puede producirse precipitación. A continuación, las moléculas de la muestra se adsorben en el material de relleno como bandas muy estrechas que se pueden eluir como picos de pequeño volumen bien resueltos. La robustez del sistema mejora con la dilución en la columna, ya que la muestra tiene una capacidad limitada para precipitar en el bucle o en la cabeza de la columna.

La resolución mejorada entre los picos de los componentes de la muestra permite aumentar el tamaño de la muestra y, por lo tanto, reducir el número de inyecciones necesarias para el aislamiento. En la práctica, con la dilución en la columna, la carga de la columna a menudo se puede aumentar de tres a cinco veces. Se reduce la incidencia de paradas por alta presión y se prolonga la vida útil de la columna.

Escalado del caudal

Para mantener con éxito la calidad de la separación durante el escalado, la velocidad lineal debe permanecer constante entre las columnas de pequeña y gran escala. Por lo tanto, el escalado del caudal funciona mejor entre columnas de gran y pequeña escala de la misma longitud, tamaño de partícula y material de relleno. Las capacidades del hardware del sistema, como el flujo máximo de la bomba y los límites de contrapresión, deben tenerse en cuenta al escalar el caudal. Si el hardware no cumple con los requisitos del caudal, se deben considerar los cambios de instrumentación adecuados para cumplir con la escala.

Ecuación 12: Escalado del caudal

Por ejemplo, si el caudal de una columna analítica (5 µm, 4,6 mm × 50 mm) es de 1,5 mL/min, se calcula el caudal en una columna preparativa (5 µm, 19 mm × 50 mm):

Escalado del tiempo del gradiente

Normalmente, no se requiere ningún cambio de gradiente durante el escalado si el caudal se ajusta para mantener la velocidad lineal de la fase móvil. Si las longitudes de las columnas son diferentes, el tiempo del gradiente debe calcularse para mantener los tiempos de separación y retención obtenidos a pequeña escala.

Ecuación 13: Escalado del tiempo del gradiente

Por ejemplo, un segmento de gradiente lineal que dura 5 minutos en una columna analítica de 50 mm será de 10 minutos en una columna preparativa de 100 mm:

Calculadora para columnas preparativas

Los cálculos de escalado de masa, flujo y gradiente también se pueden realizar en la calculadora de columnas Prep OBD. La calculadora es una aplicación fácil de usar que ayuda en todos los cálculos de escalado analítico a preparativo, incluidos la carga de masa, el volumen del sistema, los caudales, el consumo de volumen de eluyente, las relaciones de división de flujo para la cromatografía acoplada a espectrometría de masas y los métodos UPLC de gradiente enfocados a la transferencia de métodos preparativos. Se puede acceder a la aplicación en www.waters.com/prepcalculator o mediante un software de purificación basado en Waters, como ChromScope.