Cromatografía de líquidos preparativa

Si una separación isocrática o un gradiente enfocado no resuelve adecuadamente el compuesto de interés, la separación se puede volver a desarrollar mediante cambios en el eluyente, el pH, la fase estacionaria o la temperatura. Estos tipos de modificaciones pueden tener un impacto drástico en la separación, por lo que es necesario realizar exploraciones de gradientes seguidas de la optimización del método tras realizar cualquiera de estos cambios.

Eluyente

La fase móvil de HPLC consta de tres componentes: eluyente débil, eluyente fuerte y el modificador. Los eluyentes deben ser de alta pureza, compatibles con el detector, no reactivos con la muestra y tener baja viscosidad para mantener baja la contrapresión del sistema.

En la cromatografía de fase reversa, el eluyente débil casi siempre es agua, mientras que el acetonitrilo o el metanol se utilizan comúnmente como eluyentes fuertes debido a su baja viscosidad, elevada fuerza elutrópica y favorabilidad para la detección UV en el rango de longitud de onda baja. El acetonitrilo y el metanol también proporcionan la mejor forma de pico, son fáciles de evaporar después del aislamiento y tienden a no ser reactivos con la mayoría de las muestras.

Al igual que con cualquier eluyente utilizado para la separación cromatográfica, es importante permanecer por encima del valor de corte de UV del eluyente reportado durante el análisis de la muestra. Por debajo de este valor, el detector registra los cambios en la composición del eluyente como deriva de la línea base u otras alteraciones cromatográficas.

La separación y el orden de los picos pueden ser diferentes dependiendo del eluyente fuerte utilizado para la separación. Es difícil de predecir el eluyente que proporcionará la mayor resolución para el compuesto de interés; por lo tanto, la elección del eluyente fuerte a menudo se determina mediante prueba y error. Opcionalmente, se pueden mezclar eluyentes fuertes (p. ej., acetonitrilo/metanol 50:50) para lograr el orden de elución o la resolución deseados.

pH

El pH de la fase móvil es una variable muy importante en el control de la retención para las separaciones en fase reversa. Los compuestos a menudo contienen uno o más grupos funcionales ácidos o básicos, por lo que la mayoría de las fases móviles en fase reversa requieren un control del pH.

Cuando un ácido está más de 2 unidades de pH por encima o por debajo de su pK_a, estará ionizado o no ionizado al >99 %, respectivamente. Por el contrario, las bases se ionizan por debajo de su pK_a y no se ionizan por encima de su pK_a. La forma no ionizada será menos polar (más hidrofóbica) y, por lo tanto, se retendrá con más fuerza en un sistema en fase reversa. Como resultado, los ácidos se retienen mejor a un pH bajo, mientras que las bases se retienen mejor a un pH alto.

Si el pH de la fase móvil está cerca del pK_a del compuesto de interés, pequeños cambios en el pH pueden producir grandes cambios en la retención, lo que puede afectar directamente a la robustez de la separación. El pH de la fase móvil se controla añadiendo un tampón. El tampón mantiene el pH cuando se añade una pequeña cantidad de ácido o base. Es más eficaz cuando se utiliza dentro de ±1 unidad de pH de su pK_a, pero puede proporcionar un tampón adecuado a ±2 unidades de pH del pK_a.

Al seleccionar un pH de trabajo, también debe tenerse en cuenta la estabilidad de la columna.

Las columnas de sílice funcionan mejor entre un pH 2 y un pH 8. Una fase enlazada es susceptible de hidrólisis a un pH bajo y, a un pH alto, la estructura de sílice se vuelve cada vez más soluble. A pH superiores a 8, se requiere una partícula que no sea de sílice o una partícula con un ligando diseñado específicamente para lograr una alta estabilidad frente al pH. Los límites de pH y las recomendaciones generales de manipulación se pueden encontrar en el prospecto de la columna o en el sitio web del fabricante de la columna.

Cuando se vaya a utilizar un método cromatográfico con fines de purificación, los aditivos del tampón utilizados para ajustar el pH deben ser suficientemente volátiles para facilitar la eliminación del producto aislado purificado. Además, cuando se utilicen aditivos volátiles, se debe tener cuidado de evitar la contaminación o precipitación en la fuente de MS. Los aditivos habituales, como el ácido fórmico, el ácido acético y el acetato de amonio, funcionan mejor a concentraciones de 0,05-0,1 % cuando se disuelven en la fase móvil. El fosfato, el aditivo tampón más utilizado para las separaciones cromatográficas de líquidos, no está recomendado para aplicaciones de purificación ni de MS.

Se recomiendan concentraciones de tampón de entre 5 y 10 mM. Cuando se utilizan soluciones tampón, es importante filtrar la solución tampón después de la preparación y enjuagar los tubos de la bomba cuando no se utilicen para evitar la precipitación en la línea, y sustituir las soluciones periódicamente para evitar la acumulación de crecimiento biológico.

Fase estacionaria

La fase estacionaria de la columna tiene un impacto significativo en la separación. Las fases estacionarias para la fase reversa varían de C₁₈ a C₈ o pueden contener ligandos diseñados para promover la selectividad y el poder de separación. Muchos laboratorios tienen un inventario de columnas limitado, por lo que sustituir la fase estacionaria suele ser el último recurso cuando el eluyente y el pH no proporcionan una resolución adecuada. El gráfico de selectividad de columnas de fase reversa de Waters (www.waters.com) proporciona una comparación de selectividad entre diferentes fabricantes de columnas de fase estacionaria. Esta herramienta es muy útil en el desarrollo de métodos iniciales para comparar la selectividad de la columna.

Longitud

La longitud de la columna es un factor en el rendimiento de la separación. Las columnas se pueden adquirir en una variedad de longitudes que incluyen 25 mm, 50 mm, 100 mm, 150 mm y 250 mm.

Las columnas más cortas tienen recuentos de platos más bajos, pero son adecuadas para separaciones rápidas, mientras que las columnas más largas tienen recuentos de platos más altos y dan lugar a tiempos de retención más largos. Con una longitud mayor, la contrapresión, el tiempo de análisis, el consumo de eluyente y el coste aumentan proporcionalmente, por lo que la columna más corta que proporciona una resolución adecuada es la opción ideal.

Tamaño de partícula

La capacidad de la columna para resistir la dispersión o ensanchamiento de una banda de muestra a medida que pasa a través del relleno se denomina «eficacia». Los tamaños de partículas más pequeños aumentan la eficacia porque la dispersión de los picos es menor dentro de las partículas. La alta eficacia da como resultado anchos de pico estrechos y un mejor poder de separación.

Los tamaños de las partículas de la columna preparativa suelen oscilar entre 5 y 10 µm, mientras que las separaciones analíticas a presión ultra-alta utilizan tamaños de partículas de entre 1,7 y 3,5 µm. Aunque los tamaños de partícula muy pequeños proporcionan una mayor eficacia, la contrapartida es un aumento en el coste de la columna y la contrapresión del sistema. Las columnas preparativas a gran escala, que funcionan a caudales elevados con mezclas de muestras crudas, a menudo no se ofrecen en tamaños de partícula muy pequeños por estos motivos.

Temperatura

Debido a que las diferentes temperaturas pueden afectar a la selectividad, el calentamiento de las columnas es una herramienta adecuada para optimizar la separación de una muestra en particular. La viscosidad de la fase móvil y la presión total del sistema se reducen con la temperatura elevada, lo que reduce la tensión en el sistema, los conectores y la columna, lo que finalmente aumenta la robustez de la operación. La temperatura también puede reducir los tiempos de retención y cambiar la selectividad de la separación. Es difícil predecir si los cambios de temperatura aumentarán o disminuirán la resolución de los picos. Por lo tanto, la utilidad es específica para cada separación en particular.

Si bien el control de la temperatura en la cromatografía a pequeña escala es rutinario, la temperatura se emplea con poca frecuencia como parámetro para manipular la cromatografía destinada a la purificación a escala preparativa. En primer lugar, las columnas de gran diámetro pueden ser difíciles de calentar uniformemente desde el exterior. En segundo lugar, las separaciones de alto caudal utilizadas para gran escala tienden a permanecer a la temperatura del eluyente entrante. Los hornos de columnas y mantas eléctricas, aunque adecuados para separaciones a pequeña escala, no pueden calentar una columna grande uniformemente a lo largo del diámetro de la columna. Como resultado, se forman gradientes de temperatura a lo largo del diámetro de la columna, lo que afecta negativamente a la cromatografía.

Si es necesario controlar la temperatura para mantener la solubilidad de la muestra, los gradientes de temperatura se pueden superar colocando la columna preparativa en un baño de agua caliente con un trozo de tubo conectado a la cabeza de la columna. La longitud del tubo actúa como un precalentador para equilibrar el eluyente entrante a la temperatura deseada. La cromatografía prevista para futuros escalados se desarrolla mejor en condiciones ambientales y el control de la temperatura se utiliza como último recurso.