Guía completa sobre la hidrólisis y el análisis de aminoácidos

El análisis de aminoácidos por cromatografía líquida y detección óptica requiere una preparación adicional de la muestra, ya que la mayoría de los aminoácidos carecen de cromóforo y no se pueden detectar. Por lo tanto, después de la hidrólisis, el siguiente paso en un análisis de aminoácidos es la derivatización. En esta sección se describe la preparación de hidrolizados de proteínas o péptidos para la derivatización utilizando productos AccQ•Tag de Waters.

Para derivatizar de forma adecuada y fiable una muestra hidrolizada, se debe tener en cuenta lo siguiente:

• Eliminación de partículas
• Determinación de la masa de la muestra para derivatización
• Determinación de si es necesaria la neutralización de la muestra
• Uso de exceso de reactivo de derivatización basado en la masa de la muestra

Las siguientes explicaciones se han resumido por necesidad. Para obtener información adicional y orientación sobre los productos de derivatización AccQ•Tag, consulte www.waters.com/AAA.

La centrifugación puede ser necesaria si hay una gran cantidad de partículas o lípidos flotantes presentes. La centrifugación facilita la extracción de una alícuota de hidrolizado transparente para la derivatización.

Para muestras de gran volumen, como los hidrolizados para el análisis de piensos, la filtración de las partículas puede ser suficiente, teniendo en cuenta que la recuperación de las muestras puede verse afectada por la elección del material del filtro. Este factor debe tenerse en cuenta y abordarse para obtener resultados no sesgados. Póngase en contacto con el fabricante del filtro para obtener información detallada sobre el rendimiento del filtro en esta aplicación.

El método AccQ•Tag es una técnica de derivatización precolumna para el análisis de aminoácidos de péptidos y proteínas hidrolizados. El método AccQ•Tag logra lo siguiente:

• Utiliza el reactivo AccQ•Tag Ultra o AccQ•Fluor de Waters para derivatizar los aminoácidos
• Separa los derivados utilizando HPLC o UPLC de fase inversa en gradiente
• Cuantifica con exactitud los derivados utilizando patrones de aminoácidos externos y detección óptica

El reactivo de carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo (AQC) reacciona tanto con las aminas primarias como con las secundarias. El exceso de reactivo de AQC reacciona con el agua y forma 6-aminoquinolina (AMQ). La AMQ reacciona lentamente con el exceso de reactivo AQC y forma una bis-urea. Estos productos secundarios no interfieren con la separación, la identificación ni la cuantificación de los aminoácidos contenidos en los hidrolizados de péptidos o proteínas. Los derivados son estables durante días, lo que permite el procesamiento en secuencias o la repetición del análisis, si fuese necesario.

Durante muchos años, se han realizado estudios exhaustivos para garantizar la exactitud de la reacción de derivatización AccQ•Tag. La reacción química en sí requiere tanto un exceso molar del reactivo de derivatización como un pH básico (8 a 10) para la derivatización completa de todos los aminoácidos. Se han desarrollado estrategias para abordar estos factores críticos.

En la reacción en sí, la muestra se diluye normalmente 10 veces y se inyecta 1 µL de un volumen total de derivatización de 100 µL en la columna. Debido a que no todos los aminoácidos están presentes en la misma cantidad en una derivatización, la cantidad de muestra debe ser suficiente para que el aminoácido menos abundante repercuta en el límite de detección o cuantificación. Se recomienda la derivatización de al menos 1 pmol del aminoácido menos abundante, en un volumen de inyección máximo de 1 µL, para obtener una cuantificación exacta. Para determinar la cantidad de muestra necesaria, se debe realizar el siguiente cálculo:

Ejemplo de cálculo:
Para una concentración de muestra de 1,0 mg/mL de proteína:
Estimar la cantidad de muestra necesaria para el aminoácido menos abundante. En este ejemplo, se supone que se necesitan 0,03 mg/mL para administrar 1 pmol en la columna de este aminoácido.

Convertir mg a moles (el peso molecular promedio de un residuo de aminoácido en una proteína es 110).

Esta es la concentración estimada del aminoácido menos abundante en esta muestra.

Esto proporciona una dilución de 27 veces (10 ÷ 0,37 = 27).

El hidrolizado requiere una dilución de 27 veces antes de la derivatización. Por ejemplo: 5 µL  de la muestra hidrolizada se pueden diluir en 135 µL  de HCl 0,1 N para obtener este valor objetivo.

Por último, se puede transferir una alícuota de 10 µL de la dilución anterior al vial de derivatización.

Para garantizar la derivatización completa del reactivo AccQ•Tag de los aminoácidos contenidos en el hidrolizado, la muestra debe tamponarse en un intervalo de pH aproximado de 8,2 a 10,1. Si el hidrolizado ácido no se neutraliza correctamente y si el pH desciende por debajo de 8,2, la derivatización será incompleta. El efecto del pH varía para cada aminoácido. Se debe tener en cuenta que no todos los aminoácidos son afectados por igual. Los aminoácidos ácidos, como el ácido glutámico y la alanina, se ven más afectados que la serina o la fenilalanina. El pH es un factor crítico para obtener una cuantificación exacta de todos los aminoácidos de la muestra original.

• Si la solución de aminoácidos se disuelve en HCl 0,1 N, se pueden transferir de 10 a 20 µL de muestra directamente al cóctel de derivatización sin ajustar el pH. Nota: Aún es necesario asegurarse de que el reactivo de derivatización disponible se encuentre en exceso, como se describe a continuación.
• Si la solución de aminoácidos se encuentra en una mayor concentración de ácido (HCl >0,1 N), debe neutralizarse con un volumen igual de hidróxido de sodio a la misma concentración. Esto puede realizarse como una adición de volumen o integrarse en el paso de derivatización.
  • Sustituir la cantidad necesaria de tampón de borato con NaOH para neutralizar el HCl de la muestra.
  • En la mezcla del vial de reacción de derivatización, colocar 10 µL de NaOH xM y 60 µL de borato. Añadir 10 µL de la muestra de AA (en HCl xN). Derivatizar con 20 µL de reactivo AccQ•Fluor.
• Si hay dudas sobre si la neutralización es adecuada, se pueden preparar muestras de prueba y comprobar el pH final con tiras de pH de un solo uso.

ADVERTENCIA: Si la muestra se torna de color amarillo brillante al añadir el reactivo de derivatización, el pH de la muestra es demasiado bajo. Neutralizar con NaOH.

Ejemplo de cálculo:
Para determinar la cantidad de NaOH necesaria para la neutralización, realizar el siguiente cálculo.
Para la muestra anterior de proteína a 1,0 mg/mL en HCl 6 N, que debe diluirse 27 veces para garantizar que haya suficiente exceso de reactivo de derivatización en la muestra, se aplican los siguientes cálculos.

Convertir la concentración de ácido de la muestra de molar a µmoles:

Determinar la concentración final de ácido en la muestra diluida:

Recordatorio: Se pueden diluir 5 µL de la muestra hidrolizada en 135 µL de HCl 0,1 N para alcanzar este valor objetivo.

La cantidad total de NaOH necesaria por derivatización es de 0,31 M.

Debido a que el tampón de borato total añadido a la derivatización es de 70 µL, existen dos métodos de neutralización:

Añadir 10 µL de NaOH 0,31 M y 60 µL de tampón para cada derivatización.

En otro vial, mezclar 600 µL de tampón de borato y 100 µL de NaOH 0,31 M. Mezclar. Añadir 70 µL de esta mezcla + 10 µL de muestra + 20 µL de reactivo de derivatización AccQ•Tag para cada muestra.

Para la derivatización completa de todos los aminoácidos, se necesita un exceso en moles de 4 a 6 veces el reactivo de derivatización AccQ•Tag en la reacción. Si no hay suficiente reactivo, algunos aminoácidos relativamente sensibles no se derivatizarán por completo. Las velocidades de derivatización de cada aminoácido varían en función de las propiedades químicas de los aminoácidos; por ejemplo, la recuperación de alanina puede verse significativamente afectada por un exceso molar insuficiente de AccQ•Tag, mientras que la fenilalanina es más inmune a estos efectos.

Para determinar la cantidad de muestra que se debe añadir al vial de reactivo, es necesario conocer la cantidad de reactivo que hay en cada vial. El vial de reactivo AccQ•Tag estándar contiene de 3 a 4 mg de reactivo, que equivalen aproximadamente a 10 a 14 µmoles de reactivo. Debido a que el reactivo se disuelve en 1 mL de acetonitrilo y se utilizan 20 µL para cada 100 µL de reacción de derivatización, cada recipiente de reacción contiene de 210 a 280 nmoles  de reactivo de derivatización.

Debido a que cada vial de reacción contiene de 210 a 280 nmol de reactivo y se necesita un exceso molar de 4 a 6 veces para cada muestra, no debe haber menos de 40 a 140 nmoles de aminas totales en cada reacción.

Ejemplo de cálculo:
Para una muestra de proteína, utilizar el peso de la muestra y el peso promedio de un aminoácido para estimar el exceso necesario.

Por ejemplo, con una concentración de proteína de 1 mg/ml y un peso molecular promedio de 110, la cantidad de proteína en la muestra se determina de la siguiente manera:

donde el peso molecular (MW) se convierte a unidades de g/mol a µg/µmol, y

    1 mL = 103 µL

    1 mmol = 103 µmol = 106 nmol

Una vez determinada la concentración molar, se calcula la cantidad de aminoácidos en la muestra.

Utilizando la proteína de 1 mg/mL del paso 1, que requirió una dilución de 27 veces (5 µL de stock de hidrolizado + 135 µL de tampón) según la sección 6.3.1, los nmol en 10 µL de la muestra diluida se calculan de la siguiente manera:

3,3 nmol está muy por debajo del límite de 140 nmol, por lo que la muestra es aceptable.

El método AccQ•Tag de HPLC, comercializado por Waters Corporation en 1992, utiliza el mismo paso de derivatización precolumna que el método AccQ•Tag Ultra que se introdujo en 2006. El reactivo AccQ•Fluor, carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo (AQC), deriva aminas primarias y secundarias en una reacción simple de un solo paso para producir aductos fluorescentes altamente estables. Ofrecemos el método AccQ•Tag como un paquete a nivel de sistema que incluye reactivos preenvasados y una amplia documentación. El pack de productos AccQ•Tag contiene los elementos necesarios para un máximo de 250 análisis de aminoácidos hidrolizados de proteínas y péptidos.

El kit de derivatización AccQ•Tag contiene cinco conjuntos de reactivos de derivatización. Cada conjunto de reactivos incluye un vial de cada uno de los siguientes elementos:

• Tampón de borato de AccQ•Fluor: se añade a las muestras para garantizar un pH óptimo para la derivatización.
• Polvo reactivo de AccQ•Fluor: carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo. (AQC) reactivo de derivatización (se envía seco para una máxima estabilidad).
• Diluyente del reactivo AccQ•Fluor: acetonitrilo que se utiliza para reconstituir el reactivo para la derivatización.

La solución para el análisis de aminoácidos basada en UPLC de Waters está diseñada de forma integral como una solución lista para usar. Los aminoácidos derivatizados precolumna se resuelven en el sistema ACQUITY UPLC de Waters utilizando la columna UPLC de fase inversa, los eluyentes y los métodos AccQ•Tag Ultra incluidos. La robusta química de derivatización, las líneas base cromatográficas estables y la resolución superior de aminoácidos ayudan a garantizar resultados cuantitativos exactos, precisos y consistentes.

La solución para el análisis de aminoácidos basada en UPLC incluye:

• Suministros químicos AccQ•Tag Ultra de Waters, incluida la columna, los reactivos y los eluyentes; todos ellos sometidos a pruebas de control de calidad con la aplicación de análisis de aminoácidos
• Plantillas de informes, métodos y proyectos preconfigurados en el software Empower 2
• Documentación de apoyo a nivel de aplicaciones y de todo el sistema

El sistema ACQUITY UPLC de Waters admite tres detectores ópticos diferentes: detector ajustable de UV, PDA y fluorescencia.

La solución para el análisis de aminoácidos basada en UPLC incluye dos métodos completos que utilizan los mismos instrumentos y componentes químicos. El primero es adecuado para los aminoácidos derivados de los hidrolizados de proteínas. El segundo es adecuado para el mayor número de aminoácidos libres que se encuentran en las muestras de proceso, como los cultivos celulares o los caldos de fermentación. Los métodos difieren en la dilución del eluyente A de AccQ•Tag Ultra y en la temperatura de separación de la columna. El usuario no tiene que realizar ajustes de pH ni modificaciones de composición para el eluyente A o el eluyente B.

El análisis de aminoácidos de las proteínas se utiliza como parte de una determinación estructural y como una medida de la cantidad total de proteína en una muestra. La muestra se hidroliza antes del análisis. Para los análisis estructurales, las relaciones molares observadas para los aminoácidos se comparan con los valores esperados a partir de la secuencia.

Para las cantidades de proteína, se suman los pesos de los aminoácidos. Esta medida de la concentración de proteínas se utiliza para calcular los coeficientes de extinción cuando la composición de la muestra interfiere con los ensayos de proteínas comunes. Tanto el porcentaje en peso de cada aminoácido como la masa de proteína total se utilizan para evaluar el contenido nutricional de los alimentos y piensos. La solución para el análisis de aminoácidos basada en UPLC de Waters proporciona análisis sistemáticos robustos en todas estas aplicaciones.