Guía completa sobre la hidrólisis y el análisis de aminoácidos

Aunque esta guía está enfocada de forma general en los pasos iniciales del análisis de aminoácidos, haciendo hincapié en la preparación de las muestras para la hidrólisis, esta sección presenta un breve análisis de los métodos de cuantificación más comunes utilizados en el análisis de aminoácidos. En estos ejemplos, se han obtenido los resultados del análisis de aminoácidos. Es necesario calcular la concentración de la muestra original. En estos ejemplos se presupone que se han utilizado los reactivos AccQ•Tag o AccQ•Fluor para la derivatización.

Antes de continuar con la cuantificación:

• Verificar si todos los picos se identificaron correctamente.
• Si los tiempos de retención no coinciden, comprobar los valores en la tabla de calibración.
• Comprobar la integración correcta de todos los picos.

Para algunos análisis, el objetivo es simplemente determinar la concentración de la muestra analizada. Estos resultados suelen expresarse en concentraciones molares, como µmol/L. Los resultados cromatográficos se dan normalmente en picomoles. Para determinar la concentración, los picomoles de aminoácidos obtenidos por el software cromatográfico se dividen por el volumen de inyección. Luego, este valor se multiplica por el volumen de diluyente dividido por el volumen derivatizado. Para completar el cálculo, se debe multiplicar por el factor de dilución y, luego, convertir las unidades a µmoles por litro.

Ejemplo de cálculo:
Para determinar la concentración del aminoácido en la muestra original, en función del valor obtenido, se utiliza la siguiente ecuación:

Donde:

pmol AA = la cantidad obtenida para los aminoácidos en la muestra Vi = volumen de inyección en µL, normalmente 1 µL

Vd = volumen derivatizado en µL, normalmente 10 µL

Vr = volumen de diluyente utilizado para reconstituir la muestra en µL Dil. Factor = factor de dilución

Ejemplo:

Una muestra inicial de 100 µL de muestra de proteína hidrolizada se diluyó 1:1 con un patrón interno. Se derivatizó una alícuota de 10 µL. El volumen de inyección fue de 1 µL y se obtuvo un valor de 312,5 pmoles para la asparagina (Asn).

La concentración de Asn en µmol/L sería la siguiente:

Determinar la composición de aminoácidos de una proteína hidrolizada implica calcular las relaciones molares de los componentes de una muestra.

Cada proteína pura tiene un número estequiométrico específico de residuos para cada aminoácido que contiene. Lo ideal es que los resultados de un análisis produzcan relaciones molares enteras. El grado en el que los valores observados se aproximan a este ideal depende de la pureza de la proteína o del péptido, de la idoneidad de las condiciones de hidrólisis y de la calidad del análisis de aminoácidos.

Ejemplo 1 (como se refleja en la siguiente tabla):

1. Tabular los picomoles observados para cada aminoácido (obtenidos en el análisis).
2. Estimar el número de residuos (composición estimada) de cada aminoácido mediante inspección. Nota: Los residuos observados son la concentración molar relativa de cada aminoácido. Dividir todos los picomoles observados por el aminoácido menos abundante y redondear al dígito más cercano.
3. Sumar los picomoles y el número de residuos de todos los aminoácidos.
4. Calcular el promedio de pmol/residuo dividiendo la suma de picomol observada por la suma de la composición estimada.
5. Dividir cada valor de picomoles observados por el valor de picomoles/residuo para determinar la composición observada.

ADVERTENCIA: Para proteínas más grandes, la estimación del número de residuos es más difícil debido a la mayor precisión requerida.

ADVERTENCIA: La recuperación de algunos aminoácidos de la hidrólisis puede ser variable (Ser, Thr, Tyr y Met están sujetos a degradación; los enlaces Val e Ile pueden ser difíciles de separar).

Nota: Para mejorar la cuantificación en estos casos, se recomienda realizar un estudio en función del tiempo. Por lo general, las muestras se hidrolizan durante 24, 48 y 72 (o 96) horas; los valores de aminoácidos lábiles se determinan por extrapolación al tiempo cero, mientras que los valores de Ile y Val se obtienen de la hidrólisis más larga.

Ejemplo 2:
En algunos casos, como se indicó anteriormente, el cálculo del porcentaje en moles (el número de residuos de cada aminoácido por 100 residuos de proteína) puede ser satisfactorio. Esto se determina de la siguiente forma:

Si se dispone de una estimación del peso molecular de la proteína, se pueden utilizar dos métodos para calcular una composición aproximada:

1. Calcular el peso molecular de la muestra (PM).
2. Sumar los rendimientos totales de aminoácidos en picomoles.
3. Dividir el peso molecular por 110, el promedio de peso molecular de los aminoácidos. Nota: Esto proporciona una buena aproximación de la longitud total de la cadena o del total de aminoácidos.
4. Dividir el rendimiento total por la longitud de la cadena (equivale a la cantidad molar de muestra inyectada).
5. Para cada aminoácido, dividir la cantidad por la cantidad molar inyectada (equivale al número de residuos por mol). Examinar las desviaciones respecto a las cantidades en número entero.
6. Variar ligeramente el divisor (cantidad molar inyectada) hacia arriba o hacia abajo para minimizar la desviación respecto a las cantidades en número entero (obtenidas en el paso 5). Este paso se puede simplificar con un programa informático de hoja de cálculo o un software de aminoácidos personalizado que encuentre las desviaciones mínimas.
7. Recordar que los valores de los aminoácidos lábiles y los formadores de enlaces estables pueden diferir significativamente respecto a las cantidades en número entero debido a una mala recuperación de la hidrólisis.

Este procedimiento alternativo requiere conocer más sobre la muestra.

1. Elegir un aminoácido en el análisis que cumpla con los dos criterios siguientes:
   • Proporcione un buen rendimiento tras la hidrólisis y la derivatización (p. ej., Asp, Glu, His, Arg, Ala, Pro, Leu, Phe, Lys). Gly puede ser una mala elección porque es un contaminante de fondo común; y
   • Contenga pocos residuos por mol de muestra (según el peso molecular estimado de la muestra y el rendimiento de aminoácidos). Dicha información se puede obtener de otros procedimientos, como la digestión con bromuro de cianógeno, que escinde la cadena polipeptídica intacta de forma selectiva en la metionina.
2. En función de esta información, se debe elegir un valor entero para este aminoácido.
3. Dividir el rendimiento del aminoácido seleccionado por el valor entero elegido para obtener la cantidad molar estimada de muestra inyectada.
4. Seguir los pasos 5 y 6 de la sección 7.3.2.1.
5. Comprobar los valores (uno mayor y uno menor que el valor entero elegido) para ver si se obtienen desviaciones más pequeñas de los números enteros.

La concentración de péptido o proteína en la muestra original se puede calcular a partir de la suma de los productos del número de picomoles de cada aminoácido multiplicado por su peso molecular correspondiente.

Mediante el ejemplo citado en la tabla de la sección 7.3.1, el cálculo comienza de la siguiente manera:

Ejemplo de cálculo:

Para Asp (asparagina) en la muestra: 220 picomoles observados con un peso molecular para el aminoácido de 133,10 g/mol dan el siguiente resultado:

Este mismo cálculo se aplica a cada aminoácido deseado. La siguiente tabla muestra los picogramos calculados para cada aminoácido, con la suma total de los picogramos de proteína inyectados de la muestra en la parte inferior derecha.

En el análisis de alimentos y piensos, también se aplican los valores calculados mencionados anteriormente. Sin embargo, la información más importante para la mayoría de los análisis de piensos es el contenido de aminoácidos específicos que limitan el crecimiento, como la metionina y la cisteína. El valor de mayor interés es el contenido de aminoácido expresado en porcentaje en peso sobre la muestra.

Para calcular el porcentaje en peso de un aminoácido:

Ejemplo de cálculo:

El valor obtenido para la cantidad (pmol/µL) debe multiplicarse por el peso molecular del residuo MW (g/mol) y los factores de conversión.

La cantidad obtenida en g/mol después se multiplica por los factores de dilución. Luego, se divide el resultado por el peso de la muestra y, a continuación, se multiplica por 100 para convertirlo en un porcentaje.

Ejemplo de cálculo:

Donde:

    Cantidad = cantidad de aminoácidos en g/mL

    Dilución = dilución de la muestra

Peso de la muestra = peso en mg

Este método requiere el uso de un patrón interno.

Ejemplo de cálculo:

El área del pico para el patrón interno se multiplica por el peso del aminoácido en mg. Luego, se divide por el resultado que se obtiene al multiplicar el área del pico del aminoácido por el peso del patrón interno.

Donde:

    RF_aa = factor de respuesta para el aminoácido

    P_n = área del pico para el patrón interno

    P_aa = área del pico del aminoácido en la muestra

    W_aa = peso del aminoácido en mg

    W_n = peso del patrón interno en mg

El cálculo del porcentaje de contenido comienza con la multiplicación del área del pico del aminoácido por el factor de respuesta calculado. Luego, se multiplica por el factor del patrón interno. A continuación, este número se divide por el resultado que se obtiene al multiplicar del área del pico del patrón interno y el peso de la muestra analizada. Después, se convierte en porcentaje.

Donde:

    P_aa = área del pico de un aminoácido

    P_n = área del pico del patrón interno

    RF_aa = factor de respuesta calculado

    IS = factor de patrón interno calculado

Ejemplo:

Para un aminoácido en una muestra de pienso, se determinaron los siguientes valores:

    Peso del aminoácido (W_aa) = 0,5 mg

    Área del pico de aminoácido (P_aa) = 100 000

    Área de pico del patrón interno (P_n) = 110 000

    Peso del patrón interno (W_n) = 0,5 mg

    Peso de la porción de prueba (W_s) = 10 mg

0,5 mg x 2 x 10-2 = 0,05

el aminoácido en cuestión está presente a un nivel del 0,9 % en peso en el pienso.