Guía completa sobre la hidrólisis y el análisis de aminoácidos

Los péptidos y las proteínas contienen muchos aminoácidos que se unen mediante enlaces peptídicos. Estas biomoléculas, a su vez, componen muchas muestras diferentes, como productos bioterapéuticos, alimentos y piensos. Para analizar los aminoácidos que contienen estas biomoléculas, es fundamental que los enlaces se hidrolicen para formar aminoácidos liberados. Sin embargo, durante este proceso, las diferentes propiedades químicas de los enlaces de aminoácidos conjugados pueden afectar tanto a la eficacia de la ruptura de los enlaces de aminoácidos como a la recuperación de los aminoácidos individuales. Por ejemplo, la recuperación de los aminoácidos durante la hidrólisis puede verse afectada por reacciones químicas específicas, las interferencias de la matriz de los reactivos y la estabilidad de los propios aminoácidos.

Dadas las grandes diferencias en las propiedades químicas y físicas de las muestras y los aminoácidos, se han desarrollado diferentes procedimientos de hidrólisis a lo largo de los años. Estos procedimientos varían según el tipo de reacción (química o enzimática), la naturaleza de la reacción química (ácida o básica) y el estado físico de la reacción (líquida o vapor). Las diferencias pueden influir en la recuperación de aminoácidos específicos, que se pueden destruir mediante reactivos específicos, o la eficacia y el tiempo necesarios para la hidrólisis. En algunos casos, es posible que se necesiten varios procedimientos de hidrólisis para determinar el contenido total de aminoácidos de una muestra. A continuación, se describen los tipos comunes de reacciones de hidrólisis química y los modos de hidrólisis.

Nota: La hidrólisis enzimática, un procedimiento de uso poco frecuente, no se aborda en este documento.

También se debe tener en cuenta que las diversas reacciones de hidrólisis se pueden se pueden realizar con diferentes tipos de instrumentos. Históricamente, los procedimientos de hidrólisis utilizaban una fuente de calor bajo vacío para garantizar la finalización de la reacción, pero la hidrólisis inducida por microondas, con equipos más modernos, también se ha convertido en una herramienta de uso común. Los beneficios de cada método son diferentes y se deben investigar antes de seleccionar el equipo.

1.1.1 Hidrólisis ácida

La hidrólisis ácida es el método más común para hidrolizar una muestra de proteína y el método se puede realizar en fase líquida o de vapor. Aunque se puede usar una variedad de ácidos diferentes para esta reacción, el más común es el HCl 6 M. Debido a que el HCl se evapora, también se puede utilizar para recuperar el hidrolizado en cantidades más pequeñas de solución tampón, una característica que es muy útil para pequeñas cantidades de muestra. Además, la versatilidad del HCl permite su uso en hidrólisis en fase líquida o en fase de vapor.

La reacción de hidrólisis ácida con HCl 6 M da como resultado la adición de agua a cada enlace peptídico covalente, produciendo los aminoácidos individuales deseados (Figura 1). Sin embargo, no todos los aminoácidos se recuperan por completo bajo la hidrólisis con HCl. Algunos aminoácidos se hidrolizan a sus formas ácidas, como la asparagina y la glutamina, que forman ácido aspártico y ácido glutámico, respectivamente. Además, no se pueden determinar de forma fiable otros aminoácidos. Por ejemplo, el triptófano se destruye durante la reacción, mientras que los aminoácidos que contienen azufre (p. ej., cisteína, metionina) no se pueden determinar de forma fiable debido a la destrucción parcial de los aminoácidos. Además, es posible que los aminoácidos como la tirosina, la serina y la treonina tengan una recuperación menor debido a la naturaleza de la hidrólisis ácida.

Sin embargo, algunos de los aminoácidos azufrados (p. ej., cisteína, metionina) se pueden conservar en la hidrólisis ácida por HCl si se realiza un tratamiento previo. Para cuantificar con exactitud estos aminoácidos, la muestra puede oxidarse o alquilarse antes de la hidrólisis ácida por HCl. Para la oxidación, por lo general con ácido perfórmico, los aminoácidos que contienen azufre se oxidan antes de la hidrólisis ácida con HCl. Esto da como resultado una cuantificación exacta de estos aminoácidos en sus formas oxidadas. La alquilación permite alternativamente la conservación de los aminoácidos que contienen azufre (cisteína) para una cuantificación exacta en sus formas alquiladas. Dos de los reactivos de alquilación más comunes producen cisteína en cualquiera de estas dos formas, piridiletilcisteína o carboximetilcisteína. Una ventaja adicional de este proceso de alquilación es que no afecta a otros aminoácidos.

Por último, dados los desafíos para cuantificar algunos aminoácidos por hidrólisis de HCl, existen técnicas alternativas de hidrólisis ácida que se pueden aplicar para aminoácidos específicos. Una técnica utiliza ácidos sulfónicos, como los ácidos metanosulfónicos (MSA) para cuantificar el triptófano y la metionina (en forma de sulfóxido). A la vez que se trata de un reactivo no volátil, conserva el triptófano y el sulfóxido de metionina para la cuantificación.

1.1.2 Hidrólisis alcalina

Si bien la hidrólisis ácida con HCl es, por mucho, la técnica más común para hidrolizar proteínas y péptidos, a menudo se usa la hidrólisis alcalina o básica para determinar triptófano. Debido a que el triptófano es estable en condiciones básicas, esta técnica proporciona una cuantificación exacta de triptófano y se utiliza en gran medida para una variedad de muestras, desde alimentos y piensos hasta péptidos y proteínas. La hidrólisis alcalina suele utilizar NaOH o KOH como reactivo. Sin embargo, la hidrólisis alcalina no puede sustituir a la hidrólisis ácida para la cuantificación de todos los aminoácidos. En condiciones alcalinas, la arginina, la cisteína, la serina y la treonina se destruyen y no se pueden cuantificar. Otros aminoácidos también se ven afectados, por lo que la hidrólisis alcalina se usa generalmente solo para el triptófano.

Las reacciones de hidrolizado se realizan en fase líquida o vapor. Independientemente del modo, los instrumentos diseñados específicamente para la hidrólisis facilitan la reacción. Históricamente, muchas reacciones de hidrolizado se producían a altas temperaturas y al vacío durante un período de horas a días, pero con la llegada de los instrumentos de hidrólisis por microondas, el mismo proceso se puede realizar en minutos a temperaturas más bajas.

1.2.1 Hidrólisis en fase líquida

En la hidrólisis en fase líquida, la muestra y el HCl se añaden directamente al tubo de hidrólisis para la reacción. Este procedimiento requiere añadir la muestra, el patrón interno y el ácido directamente al tubo de hidrólisis. El tubo se purga con nitrógeno, después se sella y se calienta durante el tiempo necesario para completar la hidrólisis. La hidrólisis líquida puede tardar de horas a días en completarse. Este procedimiento se suele utilizar para muestras más complejas.

1.2.2 Hidrólisis en fase vapor

En la hidrólisis en fase de vapor, la muestra solo reacciona con el HCl en la fase de vapor. El procedimiento requiere colocar la muestra y el patrón interno (si se utiliza) en tubos de hidrólisis. A continuación, se seca la muestra y se coloca cada tubo abierto en un recipiente de hidrólisis. El ácido (HCl 6 M) se añade al fondo de un recipiente que contiene los tubos y, luego, el recipiente se cierra herméticamente, se hace vacío y se purga con nitrógeno. El recipiente se calienta durante el tiempo necesario para completar la hidrólisis. Este modo reduce la contaminación de cualquier reactivo impuro, como el HCl. La hidrólisis en fase de vapor por lo general se produce a un ritmo más rápido que la hidrólisis en fase líquida. En la hidrólisis en fase de vapor, generalmente las muestras deben ser de alta pureza.