펩타이드 분리를 위한 실용적 접근 방식

컬럼 선택

이상적으로는 일반 펩타이드(산성, 염기성, 무극성 잔기가 혼합된 경우), 염기성 펩타이드, 거대 펩타이드(30–40 잔기), 소수성 펩타이드를 포함한 모든 샘플에 대해 하나의 컬럼 케미스트리를 이용함으로써, 컬럼 인벤토리를 줄이고 각각의 복잡한 샘플에 대해 여러 컬럼을 선별할 필요가 없습니다. C₁₈ 상은 일반적으로 많은 펩타이드 분리에 사용되지만, C₁₈이 결합된 염기 입자는 크로마토그래피 머무름, 분리능, 피크의 모양에 영향을 미치는 중요한 요소이기도 합니다. XBridge Peptide BEH 컬럼은 순수 실리카가 아닌 에틸렌 가교 하이브리드 입자를 기반으로 이루어져 있습니다. BEH(가교된 에틸실록산/실리카 하이브리드) 입자(그림 7)는 펩타이드와의 2차 상호작용을 줄이고, 높은 pH와 낮은 pH 모두에서 안정적이므로 분리 시 유연성이 향상됩니다. 합성 충전재는 입자 크기가 3.5, 5, 10μm인 130Å 또는 300Å 공극을 가질 수 있습니다. 이례적인 샘플 또는 극소수성 펩타이드의 경우, 동일한 염기 입자가 C₈ 또는 C₄ 결합상과 함께 사용이 가능해집니다.

다양한 컬럼 치수에 대한 대략적인 펩타이드 질량 로딩 용량을 표 1에 나타내었습니다.

표 1. 역상에 대한 대략적인 펩타이드 질량 로딩 용량

*5µm 및 10µm OBD Prep 컬럼, ** 10µm OBD Prep 컬럼.

Prep 컬럼의 질량 용량에 영향을 미치는 요인은 다양합니다. 나열된 용량은 각 치수에 대한 합리적인 유량과 주입량을 가진 "평균" 추정치를 나타냅니다. 다음 요소를 고려할 필요가 있습니다.
1) 펩타이드의 용량은 주로 특정 샘플의 용해도에 따라 좌우됩니다.
2) 요구되는 분리능이 높을수록 용량이 더 낮아집니다.
3) 용량은 로딩 조건에 따라 다르지만 저분자의 경우 더 적습니다.
a) 펩타이드는 일반적으로 높은 수용성 조건에서 로딩되며, 종종 TFA가 추가됩니다. 이러한 조건에서 부피 로딩 용량은 사실상 제한이 없습니다. 용리 시 용량은 용해도에 의해 제한됩니다.
b) 건조된 펩타이드는 DMF 또는 DMSO와 같은 용매로 적셔질 수 있습니다. 이는 상기와 같이 종종 TFA를 포함한 물로 희석됩니다.
c) 일부의 경우에는 펩타이드가 DMF 또는 DMSO에 용해되어 해당 용액에 주입됩니다. 차트에 제시된 부피가 이 조건에 적용됩니다.
4) 적절한 주입 부피는 상대적으로 강한 용매를 포함하여 50mm 길이의 컬럼 직경을 기준으로 합니다. 증가된 길이는 높은 주입 부피와 호환되지만 비례하지는 않습니다. 용매가 약할수록 주입 부피는 상당히 증가합니다.
5) 적절한 유량은 컬럼 직경에 따라 결정합니다. 컬럼 길이가 증가함에 따라 역압이 늘고 입자 크기를 감소시킴으로써 시스템에 제한이 따를 것입니다. 일부 사용자는 펩타이드 분석을 저분자보다 느리게 수행하는 것을 선호하기 때문에 제안된 유량의 절반을 이용하지만 그래디언트 지속 시간은 두 배가 됩니다.

표준 펩타이드 분리에 대해 선택된 컬럼으로서, XBridge Peptide BEH C₁₈ 130 Å의 적합성은 특성이 다른 4가지 펩타이드 패널을 테스트한 후 얻은 결과에 의해 정의되었습니다. 펩타이드 서열은 고유하지만, 각 펩타이드에서 주목할 만한 특성을 표 2에 나타내었습니다.

표 2. 펩타이드 테스트 패널 특성.

펩타이드는 약산성(카복실산) 및 약염기성(아미노) 작용기가 모두 존재하기 때문에 양쪽성을 나타냅니다. 펩타이드는 양전하와 음전하를 모두 띠기 때문에, 양쪽성 이온이라고 불립니다. 특정 수소 이온 농도를 갖는 용액에 펩타이드가 용해되었을 때 전기장이 적용되고 마이그레이션 되지 않는 경우, 해당 수소 이온 농도는 펩타이드에 대한 등전점(pI)입니다. 따라서 간소화를 위해, 등전점(pI)은 펩타이드의 순 전하가 0이 되는 pH값입니다.

Browne, Bennet, Solomon이 설명한 것처럼 HPLC 지수는 완충 시스템으로 TFA:물:아세토니트릴을 이용하여 C₁₈ µBondapak 컬럼에서 펩타이드를 용리하는 데 필요한 아세토니트릴의 비율을 예측합니다. 이들은 생물학적 매트릭스에서 펩타이드를 분리하고 아미노산 조성을 기반으로 용리 프로파일을 예측했습니다. 따라서 높은 HPLC 지수 값은 C₁₈ 컬럼의 소수성 증가를 의미합니다. 값은 분명히 여러 컬럼과 이동상에 따라 변하지만, 이 간단한 시스템은 펩타이드의 특성에 대한 몇 가지 예측 정보를 제공합니다.

50분 동안 5–50% B의 그래디언트로 0.1% 포름산 수용액 및 아세토니트릴 용액의 매우 일반적인 조건 하에서 테스트 패널에 있는 4가지 펩타이드의 크로마토그래피 프로파일을 그림 8에 나타냈습니다. 네 가지 모델 펩타이드 모두 날카롭고 대칭적인 피크가 있는 완벽하게 수용 가능한 크로마토그래피를 보여줍니다.

300Å의 공극 크기 컬럼을 사용하여 거대 펩타이드 또는 소수성 펩타이드에 대한 크로마토그래피가 향상되는지 검토하는 것이 중요합니다. 39개의 잔기와 4000Da 이상의 분자량을 갖는 펩타이드 테스트 패널의 거대 펩타이드는 더 큰 공극 크기의 충전재로 채워진 컬럼에서 피크 모양이 거의 향상되지 않았습니다(그림 9). 펩타이드는 조금 더 일찍 용리되며, 1–2%의 아세토니트릴에 상당하는 차이가 있습니다. 130Å 공극 크기 충전재 사용 시 일부 크기 제한이 있습니다. 이는 약 40개 이상의 잔기가 있을 가능성이 높습니다.

또한 HPLC 지수가 113인 소수성 펩타이드는 130Å과 300Å 충전재 모두에서 날카롭고 대칭적인 피크로 용리됩니다(그림 10). 펩타이드가 용액에서 접히는 방식인 펩타이드 구조도 특정 분리를 위한 최상의 공극 크기를 선택하는데 영향을 미칠 수 있습니다. 펩타이드 로딩 용량에 대한 견고하고 빠른 규칙이 없듯 개별적인 펩타이드 특성 또한 사용할 최상의 공극 크기를 결정하는 데 영향을 미치게 됩니다. 위에서 논의된 실험으로부터, C₁₈ 결합상과 130Å 공극을 갖는 XBridge 펩타이드 BEH 컬럼이 펩타이드 분리의 시작점으로 합리적인 선택임을 알 수 있습니다.

대량 펩타이드 분리를 수행하는 데 있어 경제성과 효율성의 관점에서, 입자 크기를 고려하는 것이 중요합니다. 3개의 서로 다른 입자 크기 컬럼에서 실행되는 염기성 펩타이드는 분리의 일관성을 보여줍니다(그림 11). 입자 크기가 클수록 피크가 넓고 분리능은 감소하지만, 규모 조정이 가능한 BEH 컬럼 충전재의 경우, 3.5μm, 5μm, 10μm의 입자 크기에 관계없이 화학적인 선택성은 변하지 않습니다. 대량 분리는 넓은 직경의 컬럼에서 더 빠른 유량을 허용하는 증가된 입자 크기와 관리 가능한 압력 한계의 이점을 활용하며, 이 모두가 로딩 용량을 개선하고, 크로마토그래피 분석 횟수를 줄이며, 시간과 자원을 절약하는 결과로 이어집니다.

비록 펩타이드가 원래 혼합물의 성공적 분리에 영향을 미치는 독특한 특성을 가지고 있지만, 분취 크로마토그래피의 기본 원리는 여전히 적용됩니다. 역상 컬럼에 일반적인 그래디언트(예: 5–50%B 또는 5–95%B)를 이용하는 표준 펩타이드 분리 프로토콜은 대부분의 경우에 사용 가능하지만, 고유한 특성을 가진 펩타이드들은 순도, 로딩 또는 수율 요건을 실현하기 위해 분리 분석법 개발이 필요한 경우가 있습니다. 분리 분석법은 보통 이동상 용매, 변형제, 그래디언트 기울기, 온도, pH 또는 샘플 주입 방법을 변경하여 개선할 수 있습니다. 이러한 각 요소들은 분리, 크로마토그래피의 품질, 그리고 분리의 궁극적인 성공에 영향을 미치게 됩니다.

용매의 역할

이동상은 약용매, 강용매, 변형제의 세 가지 성분으로 구성되어 있습니다. 역상 크로마토그래피에서 약용매는 거의 항상 물입니다. 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올이 강용매의 역할을 하는 것으로 생각될 수 있지만, 아세토니트릴은 점도가 낮고 용매 세기가 약간 높으며 낮은 파장 UV 검출 범위(185–205nm)에서 그 유용성을 높이 평가받아 일반적으로 선택되는 용매입니다. 아세토니트릴은 일반적으로 월등한 피크 모양을 제공하며, 쉽게 증발하고, 분리와 워크업 과정에서 진행될 수 있는 부반응의 횟수를 감소시킵니다. UV 투과성이 좋으면 신호대 잡음비가 높아 피크 검출이 더 잘 됩니다. 그러나 일부 사용자는 생물학적 테스트에서 펩타이드를 사용하려는 경우 아세토니트릴을 사용하지 않으려고 할 수 있습니다.

에탄올과 같은 알코올을 대체하면 아세토니트릴과 관련된 잔류 독성이 감소합니다. 생물학적 적합성에 대한 우려 외에도 프로판올 또는 아세토니트릴:프로판올 혼합물은 종종 거대 펩타이드 또는 소수성 펩타이드의 용해도를 증가시키고 용액에서 때때로 형성되는 응집체를 분해시킵니다. 70% 이소프로판올:30% 아세토니트릴이 염기성 펩타이드에 미치는 영향은 그림 12와 같습니다. 주 피크는 가장 근접하게 용리되는 오염 물질과 잘 분리되어 분리능이 개선되고 머무름 시간은 대략 절반으로 감소합니다. 알코올이 포함된 이동상에서는 점도가 높기 때문에 일반적으로 컬럼 온도를 높여야 합니다.

이동상 변형제의 역할

펩타이드는 충전재의 소수성 표면에 대한 친화력을 감소시키는 양전하(아미노 말단)와 음전하(카복실 말단)를 모두 가지고 있기 때문에 역상 크로마토그래피를 이용한 펩타이드의 분리 과정에서는 이동상에 극성 변형제를 추가해야 합니다. 또한 곁사슬 보호기는 그림 13과 같이 전하를 전달할 수도 있습니다. 변형제는 pH를 조절하여 약산성 또는 약염기성 곁사슬의 이온화 정도를 변화시킵니다. 변형제는 또한 펩타이드와 이온쌍을 형성할 수 있습니다. 이러한 메커니즘을 조작하여 특정 샘플에 대한 분리 과정을 최적화할 수 있습니다.

포름산은 이동상의 pH를 낮춤으로써 펩타이드의 산성 곁사슬을 양성자화하고 음전하의 일부를 제거합니다(그림 14). 전하를 띠는 아미노산 곁사슬의 수가 감소하면 컬럼의 소수성 표면에 대한 결합력이 증가하여 더 잘 분리됩니다. 컬럼 표면에 있는 대부분의 실라놀은 양성자화 될 수도 있지만, 자유 실라놀은 여전히 펩타이드와 결합할 수 있습니다. 이러한 펩타이드-실라놀 상호작용은 크로마토그램에서 피크 테일링 현상으로 나타납니다.

가장 일반적으로 사용되는 변형제인 트리플루오로 아세트산(TFA)은 컬럼과 샘플에 대한 상호작용 메커니즘이 다릅니다(그림 15). 낮은 pH는 산성 펩타이드 곁사슬을 양성자화하고, 이온쌍은 염기성 곁사슬을 중성화시켜 피크 테일링 현상을 유발하는 자유 실라놀과의 결합을 억제하게 됩니다. 전하 감소와 이온쌍 증가의 효과로 머무름이 증가하므로 용리를 위해 유기 용매의 농도를 높여야 합니다.

가교된 에틸 하이브리드 입자가 있는 컬럼을 사용할 때의 이점은 실라놀 상호작용을 제거할 수 있다는 것입니다(그림 16). 염기성 충전재는 펩타이드와의 상호작용이 적기 때문에 더 이상 피크 테일링 현상을 줄이기 위해 TFA가 필요하지 않습니다. 대신, 양호한 피크 모양을 유지하면서 분리 선택성의 개선을 위해 포름산(FA) 또는 TFA를 사용할 수 있습니다. 머무름의 차이와 용리 순서의 변화는 그림 17과 같이 정제 조건을 조정하는 데 사용할 수 있습니다. 별표는 두 가지 분리 과정에서 동일한 오염물질 펩타이드를 식별하는 것으로, 상당한 선택성 개선과 유용한 변화를 확인시켜 줍니다.

증가된 pH의 역할

pH의 상승 또한 펩타이드와 가교된 에틸 하이브리드 컬럼 표면 사이의 상호작용을 변화시키는 데 사용될 수 있습니다. Ammonium bicarbonate와 같은 완충액을 사용하면 높은 pH에서 산성 펩타이드 곁사슬이 탈양성자화 및 이온화 됩니다(그림 18). 또한 탄산수소 암모늄은 염기성 펩타이드 곁사슬을 탈양성자화 및 중성화시켜 펩타이드 전하를 감소시키고 소수성 컬럼 표면에 대한 결합력을 증가시킵니다. 염기성 펩타이드 곁사슬은 나머지 소수 실라놀에 결합하지 않으며, 피크 테일링 현상을 감소시킵니다. 이러한 이점 외에도 ammonium bicarbonate는 휘발성이 있으며 정제된 펩타이드 생성물에서 비교적 쉽게 제거할 수 있습니다. 0.1%의 Ammonium hydroxide도 이동상의 pH를 높이는 데 사용될 수 있으며, 수집된 분취물에서 쉽게 증발됩니다.

극한의 pH는 분리의 선택성을 변화시킵니다(그림 19와 20). 산성 펩타이드(그림 19)는 모든 음전하가 중성화 되고 펩타이드가 소수성 컬럼 표면과 강하게 상호작용하기 때문에 낮은 pH의 역상 충전재에서 더 잘 머무르게 됩니다. 반면, 높은 pH에서 펩타이드는 더 많은 수의 음전하로 인해 더 이른 머무름 시간으로 이동하며, 이는 펩타이드가 컬럼 충전재에 강하게 부착되는 것을 방지합니다. 이 예시에서, 피크 모양은 영향을 받지 않지만, 분석법 개발에 용리 순서의 변화를 이용하거나 직교 전략으로 펩타이드를 특성화할 수 있습니다.

염기성 펩타이드(그림 20)는 예상되는 바와 같이 극한의 pH에서 역의 효과를 나타냅니다. 높은 pH에서 펩타이드의 염기성 잔기는 탈양성자화 및 비이온화 됩니다. 펩타이드와 컬럼의 강한 상호작용으로 인해 컬럼에서 펩타이드를 용리하기 위해 더 높은 비율의 유기 이동상이 요구됩니다. pH 10에서 선택성의 변화는 분리능 향상으로 이어지기 때문에 높은 순도의 펩타이드 분리를 목표로 하는 작업에서는 높은 pH를 더 선호합니다.

알림: 낮은 pH와 높은 pH에서의 이동상은 하이브리드 입자 기술 컬럼과 호환되지만, 극한 pH에서의 분석법 조건은 실리카 기반 컬럼 충전재와 함께 사용해서는 안 됩니다. pH가 지나치게 낮으면 결합상이 끊어집니다. 높은 pH는 실리카 입자 컬럼의 기질을 파괴시킵니다. 특정 실리카 기반 컬럼에 대해 제조업체가 제안하는 pH의 한계 범위를 반드시 확인하십시오.

온도의 역할

온도 조절은 크로마토그래피에서 재현성 있는 분리를 보장하기 위해 가장 자주 사용됩니다. 분리 및 정제 과정에서 이는 몇 가지 추가적인 이유로 중요하게 작용합니다. 용해도가 제한적인 소수성 펩타이드는 가장 정제하기 어려운 샘플 중 하나입니다. 분리 온도를 높이면 소수성 펩타이드의 용해도가 증가하며, 일반적으로 크로마토그래피 피크 모양이 개선됩니다. 이를 통해 궁극적으로 분리의 순도와 회수율이 향상되어 분리가 보다 빠르고 효율적으로 이루어집니다.

온도마다 크로마토그래피 선택성이 다르기 때문에 컬럼 가열은 특정 샘플의 분리를 향상시키는 데 매우 편리한 도구입니다. 또한, 높은 온도에서는 이동상 점도와 전체 시스템 압력이 감소하게 됩니다. 시스템 압력이 낮아지면 시스템, 피팅 및 컬럼에 가해지는 변형률이 감소하며, 궁극적으로 보다 안정적인 운영이 보장됩니다.

온도 조절은 분석 크로마토그래피에서 일반적으로 이용되지만, 분취 스케일에서 크로마토그래피를 조작하기 위한 파라미터로 사용되는 경우는 드문데, 여기에는 두 가지 이유가 있습니다. 첫째, 직경이 큰 컬럼은 외부로부터 균일하게 가열될 수 없습니다. 둘째, 유입되는 용매의 온도에서 고유량 분리 과정이 실제로 발생합니다. 전기 담요와 컬럼 오븐은 소량 분리 과정에 적합하지만 대형 컬럼을 균일하게 가열할 수 없습니다. 온도 그래디언트가 컬럼의 전체 직경과 길이에 걸쳐 형성되어 크로마토그래피에 악영향을 미칩니다.

컬럼 헤드 부분에 용매 예열 루프를 삽입하고, 원하는 온도로 평형화된 수조에 루프와 컬럼을 완전히 담그면 컬럼이 효과적으로 가열됩니다(그림 21). 예열 루프를 통해 연속적으로 흐르는 용매는 컬럼을 내부적으로 평형화하고, 수조는 외부 컬럼 환경을 안정화시킵니다. 용매 예열 루프로 인한 띠 넓어짐은 좁은 내경의 튜브로 구성되기 때문에 무시할 수 있는 수준입니다. 유입되는 샘플은 또한 컬럼 헤드 부분에 흡착되어 다시 포커싱됩니다.

염기성 펩타이드(그림 22)와 산성 펩타이드(그림 23)의 두 가지 테스트 패널 펩타이드를 대상으로 펩타이드 분리에 온도 조절을 적용할 때의 효과를 나타내었습니다. 이러한 예시(빨간색으로 강조됨)에서, 염기성 펩타이드의 샘플 성분은 60°C에서 더 잘 분리되는 반면, 산성 펩타이드 미처리 혼합물 성분은 40°C에서 더 잘 분해됩니다. 그러나 산성 펩타이드 또는 염기성 펩타이드의 최적 온도를 예측하는 것은 거의 불가능하며 개별적인 염기 서열의 특정한 특성에 따라 달라지기 때문에 이러한 관찰은 순전히 우연의 일치일 수 있습니다.

용매, 이동상 변형제, pH, 온도를 변화시키면 펩타이드 분리에 큰 영향을 미치며, 이러한 파라미터 중 하나를 크로마토그래피 최적화를 위한 분석법 개발 도구로서 단독으로 또는 병행하여 사용할 수 있습니다. XBridge 펩타이드 BEH 컬럼 기술과 같이 안정적인 하이브리드 입자로 패킹된 하나의 컬럼을 선택하여 펩타이드 분리에 필요한 컬럼 수와 스크리닝 시간을 줄임으로써 정제 과정을 단순화할 수 있습니다. 그림 24에서 염기성 펩타이드의 크로마토그래피를 통해 작은 변화가 분리에 미치는 영향을 보여줍니다. 고유한 특성을 가진 펩타이드의 경우, 다른 컬럼 케미스트리가 분리 향상에 유용할 수 있습니다.

그래디언트 포커싱

분리 및 정제를 위한 크로마토그래피 분리는 분석적 분리와 동일한 물리적, 화학적 원리에 의해 좌우됩니다. 그러나 분취 실험에서 과학자들은 종종 대형 컬럼에서 높은 질량 로딩으로 화합물을 분리하고, 수집된 생성물의 순도와 회수율을 높이기 위해 보다 높은 분리능을 필요로 합니다. 완만한 그래디언트를 생성하는 것은 분리능을 향상시키는 좋은 첫걸음이지만 전체 분리의 그래디언트 기울기를 변화시키면 피크가 넓어지고 총 실행 시간이 증가할 수 있습니다. 분할되고 포커싱된 그래디언트는 총 실행 시간을 늘리지 않으면서 분리능을 높여야 하는 분리 부분에 대해서만 그래디언트 기울기를 낮춥니다(그림 25 및 26).

선형 그래디언트는 정의된 기간 동안 낮은 유기 조성에서 높은 유기 조성(즉, 5–50%B 또는 5–95%B)으로 진행되며 샘플 스크리닝에 많이 사용됩니다. 샘플 성분 간에 분리능이 양호하고 실행 시간이 상당히 짧은 경우에는 분취 크로마토그래피에도 사용할 수 있습니다. 분할 그래디언트는 분석법의 더 완만하고 포커싱된 부분 전후에 동일한 기울기를 유지하며, 이러한 분리 부분에 대한 크로마토그래피 프로파일을 보존합니다. 크로마토그램의 더 완만하고 포커싱된 부분은 그래디언트 기울기가 감소하여 표적 피크와 근접하게 용리되는 불순물을 효과적으로 제거합니다.

포커싱 그래디언트는 생성물만을 표적으로 합니다. 용매 세기는 샘플 로딩에 사용되는 저농도에서 생성물 피크의 예상 용리 포인트보다 약 5% 낮은 수준까지 빠르게 증가합니다. 일반적으로 크로마토그램의 완만한 부분은 원래 분리의 약 5분의 1 기울기에서 생성물 피크의 예상 용리보다 약 3% 이상까지 진행됩니다. 그래디언트의 완만한 부분이 완료되면 유기 이동상의 비율이 빠르게 증가하여 컬럼에서 남아 있는 오염물질을 씻어냅니다. 펩타이드 혼합물의 복잡성 때문에 대략 0.25%–0.33%의 변화/컬럼 부피 부근에서 최상의 분리능이 얻어지는 경우가 많은데, 이는 저분자와 덜 복잡한 펩타이드 샘플에 사용되는 원래의 스크리닝 그래디언트 기울기의 5분의 1보다 약간 더 완만한 기울기입니다.

시스템 부피는 분석에서 분취로의 기본적인 스케일 조정뿐만 아니라 포커싱 그래디언트를 설계하는 데 사용됩니다. 지연 부피 또는 드웰부피(dwell volume)라고도 하는 시스템 부피는 그래디언트 형성 지점에서 컬럼 헤드까지의 부피로 정의되며, HPLC 유동 경로, 펌프 헤드, 맥류 차단기, 믹서, 주입기 루프 및 튜브의 모든 구성 요소를 포함합니다. 기울기가 분석 및 분취 스케일 모두에서 보존되는 기하학적 스케일링에서, 시스템 부피는 그래디언트가 시작되기 전에 등용매 유지를 발생시킵니다. 이 홀드 부피는 작은 스케일에서는 컬럼 부피의 몇 배 또는 큰 스케일에서는 컬럼 부피의 일부일 수 있습니다. 초기 조건에서 프로그래밍된 등용매 유지를 사용하여 분석 및 분취 스케일 간의 시스템 부피 차이를 보상함으로써 실제 그래디언트가 정확히 동시에 시작되도록 합니다.

이동상 A 용매가 니트 상태이고 이동상 B 용매가 적절한 UV 흡수제(즉, 아세톤 2mL/L)를 포함하는 스텝 그래디언트(표 3)를 사용하면 그림 27과 28에 나타낸 절차 및 계산법을 이용하여 시스템 부피를 쉽게 계산할 수 있습니다.

표 3. 분석 및 분취 시스템 부피 측정을 위한 계단식(step) 그래디언트.

시스템 부피, 컬럼 부피, 펩타이드를 용리하는 강용매의 비율을 추정한 다음 이러한 추정으로부터 분할 또는 포커싱 그래디언트를 생성하여 시간을 절약할 수 있지만, 실험을 통해 시스템 부피를 결정하고 향후 실험을 위해 이러한 값을 기록하는 것도 의미가 있습니다. HPLC 배관을 변경하지 않고 분석법 유량이 시스템 부피를 측정하는 데 사용되는 유량과 동일하다면 시스템 부피는 일정하게 유지될 것입니다. 시스템 부피가 실험을 통해 측정되면 시스템에 대한 수정(주입기 루프 크기 변경 등)이 쉽게 계산되고 추가적인 부피 측정이 필요하지 않습니다. 시스템 부피가 측정되면 포커싱 그래디언트 계산에 사용할 수 있습니다.

포커싱 그래디언트 설계

포커싱 그래디언트는 보통 미처리 샘플 혼합물의 분석을 기반으로 설계되지만, 절차는 초기 분취 실행에서 이미 사용된 그래디언트를 수정하는 것과 동일합니다. 아래에 표시된 수식을 사용하면 포커싱 그래디언트를 쉽게 생성할 수 있습니다. 다음의 그래디언트가 포커싱 그래디언트를 설계할 대상이라고 가정합니다: 4.6 X 100mm 컬럼, 시스템 부피 1.0mL, 컬럼 부피 1.097mL*
피크 머무름 시간 = 7.76분

*컬럼 부피는 웹에서 이용 가능한 계산기를 사용하거나 실린더의 부피인 V = πr2h를 사용하여 측정할 수 있습니다. 일부 계산기는 컬럼 충전재를 고려하여 액체 부피를 줄이기 때문에 선택한 분석법에 따라 값이 약간의 차이를 보입니다. 모든 계산에 동일한 분석법을 사용하기만 한다면 크로마토그래피에는 영향을 미치지 않습니다.

그림 29는 이 그래디언트로 분석한 미처리 합성 펩타이드의 크로마토그램을 보여줍니다.
그래디언트 형성 지점과 검출기 사이의 오프셋 계산

오프셋 = 시스템 부피 + 컬럼 부피

예시:
오프셋 = 1.0mL + 1.097mL
오프셋 = 2.097mL
용매가 검출기에 도달하는 시간 계산
검출기에 도달하는 시간 = mL 단위의 오프셋
mL/분 단위의 유량

예시:
검출기에 도달하는 시간 = 2.097mL/1.46mL/분
검출기에 도달하는 시간 = 1.43분

피크 용리 농도가 형성된 시간 계산

용리 농도가 형성된 시간 =
피크 머무름 시간 – 검출기에 도달하는 시간 – 그래디언트 유지 시간

예시:
용리 농도가 형성된 시간 = 7.76분 – 1.43분 – 0.00분
용리 농도가 형성된 시간 = 6.33분

피크 용리율(%) 계산

용리 농도 % =
용리 농도가 형성된 시간/길이 파일럿 X 변경 파일럿/
그래디언트 분할 + 초기 파일럿 그래디언트 %/그래디언트 분할

예시:
용리 농도 % = 6.33분/10분 X 45% + 5%
용리 농도 % = 33.48%

참고: 백분율을 포함하는 모든 계산에는 절대값(즉, 0.45 X 6.33분이 아닌 45 X 6.33분)만 사용하십시오.

파일럿 그래디언트 기울기를 컬럼 부피당 변화율(%)로 계산

# 컬럼 부피(CV) =
1 CV X 유량(mL) X 그래디언트 분할 시간 X mL 분

예시:
# 컬럼 부피 = 1CV X 1.46mL X 10분/1.097mL 분
# 컬럼 부피 = 13.3CV

예시:
파일럿 그래디언트 기울기 = 파일럿 그래디언트 변화율(%)
파일럿 그래디언트 기울기 = 45%/13.3CV = 3.38%/CV

컬럼 부피당 변화율(%)로 포커싱 그래디언트 기울기를 계산합니다. 파일럿 그래디언트 기울기의 5분의1을 사용합니다.

%/CV의 포커싱 그래디언트 기울기 = 1/5 × 파일럿 그래디언트 기울기

예시:
포커싱 그래디언트 기울기 = 1 X 3.38%/5CV
포커싱 그래디언트 기울기 = 0.67%/CV

예상 용리 백분율보다 5% 이하에서 3–5% 이상까지 높은 포커싱 그래디언트 분할을 생성합니다. 피크는 33.5% 아세토니트릴에서 용리됩니다. 완만한 그래디언트는 28%에서 36%의 아세토니트릴이어야 합니다. 포커싱 그래디언트 분할에 대한 시간을 계산합니다.

포커싱 그래디언트 분할 시간 =
변화율(%) X 포커싱 그래디언트 기울기 X 컬럼 부피 X 유량(mL)

예시:
포커싱 그래디언트 분할 시간 =
8% X 1CV/0.67% X 1.097mL/1CV X 1분/1.46mL
포커싱 그래디언트 분할 시간 = 9.0분

파일럿 실행의 초기 조건에서 시작하여 피크에 대한 용리율(%) 아래 5%까지 빠르게 변화하는 포커싱 그래디언트를 작성합니다.

그림 30의 상단 패널은 포커싱 그래디언트를 이용하여 분석한 미처리 펩타이드의 크로마토그램을 보여줍니다. 가깝게 용리되는 불순물은 더 잘 분리되었지만, 초기 기울기(하단 패널)의 약 10분의 1로 기울기를 줄일 경우 불순물의 분리능이 가장 우수하였습니다. 이 예시는 복잡한 펩타이드 혼합물의 분리와 관련하여 컬럼 부피당 0.25–0.33%의 변화율까지 기울기를 감소시킬 때의 영향을 명확하게 보여줍니다. 펩타이드 주 피크의 머무름 시간은 여전히 약 7분 정도이며, 이는 원래 스크리닝 그래디언트와 거의 동일합니다. 따라서 그래디언트를 포커싱할 경우 실행 시간을 늘리지 않으면서 분리능을 높일 수 있었습니다. 전체 그래디언트에 대한 총 실행 시간은 더 길지만, 큰 규모의 분리 프로세스 속도를 높이기 위해 조기 실행 종료와 같은 다른 기법을 사용할 수 있습니다. 이 펩타이드는 궁극적으로 더 완만한 포커싱 그래디언트를 기하학적으로 스케일링하여 분리되었습니다.

샘플 도입

펩타이드의 조성과 서열이 용해도에 직접적으로 영향을 미치기 때문에 합성 펩타이드를 용해시키는 범용적인 용매나 기법은 없습니다. 유용한 용매로는 트리플루오로 아세트산 , 포름산 또는 아세트산 0.1–2% 수용액, 디메틸설폭사이드, 헥사플루오로이소프로판올, 6–12M 구아니딘-HCl, 디메틸포름아마이드, 0.1% 수산화암모늄 또는 10M 탄산수소 암모늄 수용액이 있습니다. 제조업체에서 때로 여러 유형의 펩타이드를 용해하기 위한 실용적 지침을 제공하기도 합니다. 펩타이드를 용해하면 강용매에 상대적으로 많은 양의 샘플을 얻을 수 있습니다.

기존의 분취 크로마토그래피 시스템(그림 31)에서는 강한 샘플 희석액을 대량으로 주입하면서 크로마토그램이 왜곡되어 성공적으로 분리할 수 있는 생성물의 양이 줄어드는 경우가 많습니다. 로딩이 증가함에 따라 가깝게 용리되는 불순물의 분리능이 떨어집니다. 샘플이나 루프 또는 컬럼 헤드 부분에 수용성 이동상이 존재함으로 인해 샘플 침전이 발생하여 시스템 견고성과 컬럼 수명이 줄어듭니다.

기존 분리의 경우, DMSO에서 컬럼에 도입된 샘플 또는 일부 다른 강용매는 즉시 컬럼을 따라 이동하기 시작하면서 샘플 분자를 운반합니다(그림 32). 샘플은 강용매가 컬럼에서 희석될 때까지 머무르지 않습니다. 안타깝게도, 샘플 밴드가 컬럼에 머무르게 될 때 이미 폭이 넓어 다른 컬럼 베드로 마이그레이션됩니다. 샘플 성분이 컬럼에서 용리될 때 밴드가 구별되지 않고 각 성분에 대해 정확한 순도를 얻을 수 없습니다.

대체 주입 기술인 At-Column Dilution(ACD)는 강용매의 대량 주입을 가능하게 하고, 동시에 샘플 용해도, 컬럼 로딩 및 분리능을 향상시킵니다. ACD의 경우 크로마토그래피 시스템을 배관하여 컬럼 헤드에서 강용매의 샘플을 수용성 이동상으로 희석합니다(그림 33). 샘플이 매우 빠르게 혼합되어 컬럼에서 흡착됩니다. 이동 속도가 너무 빨라 침전이 발생할 수 없습니다. 강용매는 샘플 용리가 시작되기 전에 컬럼에서 즉시 플러싱되기 시작합니다.

그래디언트가 시작되면 샘플 성분은 좁고 낮은 부피로 선명하게 분리된 밴드로 용리됩니다(그림 34).

샘플 성분 피크 간의 분리능이 향상되어 샘플 크기를 증가시킴으로써 분리에 필요한 주입 수를 줄일 수 있습니다. 실제로 At-Column Dilution을 사용하면 컬럼 로딩을 3배에서 5배까지 증가시킬 수 있는 경우가 많습니다(그림 42). At-Column Dilution을 사용하면 샘플이 루프 또는 컬럼 헤드에 덜 침전되므로 시스템 견고성이 향상됩니다. 고압 셧다운 발생률이 감소하고 컬럼 수명이 연장됩니다.

실용적 펩타이드 분리 예시

분취 크로마토그래피의 원리는 펩타이드를 포함한 모든 종류의 분자에 적용됩니다. 다음 예시에서는 연구 환경에서 펩타이드를 분리하기 위한 일반적인 워크플로우를 보여주며, 상기 제시된 분석법 최적화의 여러 인자들을 적용해 보겠습니다. 이 절차는 실험실의 프로세스 요건에 따라 수정될 수 있습니다.

본 예시에서 사용된 펩타이드는 염기성 3개, 산성 2개, 무극성 8개, 극성 잔기 4개, 총 17개의 아미노산으로 구성되었습니다, 샘플은 디메틸설폭사이드에 용해한 후 볼텍싱 및 초음파 처리하고 0.45μm GHP Acrodisc 실린지 필터를 통과시켰습니다. 펩타이드 단일 동위원소 질량은 1772.9Da였으며 다음과 같은 전하 상태를 가졌습니다.
[M+H]⁺ = 1773.9
[M+2H]²⁺ = 887.5
[M+3H]³⁺ = 592.2
[M+4H]⁴⁺ = 447.2

미처리 펩타이드 프로파일

미처리 펩타이드 샘플은 이동상에서 두 가지 다른 변형제(0.1% 포름산 및 0.1% 트리플루오로 아세트산)로 분석하여 어떤 것이 더 나은 분리를 제공하는지 측정했습니다. 이동상의 유기 성분으로 아세토니트릴이 가장 많이 사용되지만, 본 예시에서는 설명의 목적상 이소프로판올을 대신 사용하였습니다. 그 결과는 그림 35에 나타난 바와 같으며, TFA 변형제(A와 B)가 포름산(C와 D)에 비해 오염물질로부터 더 잘 분리되어 보다 선명한 생성물 피크를 얻었으며 40°C에서 진행했습니다. 또한 25°C와 60°C에서의 분리도 평가하였으나, 40°C에서 샘플 성분 피크의 피크 모양과 분리능이 가장 우수하였습니다(그림 36). 온도가 약간 높아짐에 따라 이동상의 유기 성분인 이소프로판올로 인해 시스템 역압 또한 감소하였습니다.

그래디언트 포커싱

미처리 펩타이드 분석에 맞게 이동상 변형제와 온도를 최적화한 후, 근접하게 용리된 오염물질 피크로부터 더 잘 분리되게 하기 위해 그래디언트를 포커싱하였습니다. 4.6 × 50mm 컬럼의 부피는 0.698mL이고 시스템 부피는 0.77mL로 측정되었습니다. 미처리 펩타이드 분석에 사용되는 HPLC 분석법은 다음과 같습니다:

그래디언트 형성 지점과 검출기 사이의 오프셋 계산

오프셋 = 시스템 부피 + 컬럼 부피

예시:
오프셋 = 0.77mL + 0.698mL
오프셋 = 1.468mL

용매가 검출기에 도달하는 시간 계산

검출기에 도달하는 시간 =
오프셋(mL)/유속(mL/분)

예시:
검출기에 도달하는 시간 = 1.468mL/1.46mL/분
검출기에 도달하는 시간 = 1.00분

피크 용리 농도가 형성된 시간 계산

용리 농도가 형성된 시간 =
피크 머무름 시간 – 검출기에 도달하는 시간 – 그래디언트 유지 시간

예시:
용리 농도가 형성된 시간 = 3.23분 – 1.00분 – 0.50분
용리 농도가 형성된 시간 = 1.73분

피크 용리율(%) 계산

용리 농도 % =
용리 농도가 형성된 시간/길이 파일럿 X 변경 파일럿/그래디언트 분할 +
초기 파일럿 그래디언트 % / 그래디언트 분할

예시:
용리 농도 % = 1.73분 X 30% + 0% / 4.78분
용리 농도 % = 10.85%

참고: 백분율을 포함하는 모든 계산에는 절대값(즉, 0.30 X 1.73분이 아닌 30 X 1.73분)만 사용하십시오.

파일럿 그래디언트 기울기를 컬럼 부피당 변화율(%)로 계산

# 컬럼 부피(CV) =
1 CV X mL 유량 X 그래디언트 분할 시간 X mL 분

예시:
# 컬럼 부피 = 1CV X 1.46mL X 4.78분/0.698 mL 분
# 컬럼 부피 = 9.99
파일럿 그래디언트 기울기 = 파일럿 그래디언트 변화율(%)
# 컬럼 부피

예시:
파일럿 그래디언트 기울기 = 30%/9.99CV = 3.0%/CV

컬럼 부피당 변화율(%)로 포커싱 그래디언트 기울기를 계산합니다. 파일럿 그래디언트 기울기의 5분의1을 사용합니다.

%/CV의 포커싱 그래디언트 기울기 =
1/5 X 파일럿 그래디언트 기울기

예시:
포커싱 그래디언트 기울기 = 1 X 3.0%/5CV
포커싱 그래디언트 기울기 = 0.6% / CV


예상 용리 백분율보다 5% 이하에서 3–5% 이상까지 높은 포커싱 그래디언트 분할을 생성합니다. 피크는 10.85% 아세토나이트릴에서 용리되었으며, 따라서 완만한 그래디언트는 5–13% 아세토니트릴에서 6.37분 동안 실행되도록 설계되었습니다.

포커싱 그래디언트 분할 시간 =
변화율(%) X 포커싱 그래디언트 기울기 X 컬럼 부피 X 유량(mL)

예시:
포커싱 그래디언트 분할 시간 = 8%/0.6% X 0.698mL/1 CV X 1분/1.46mL
포커싱 그래디언트 분할 시간 = 6.37분


파일럿 실행의 초기 조건에서 시작하여 피크에 대한 용리율(%) 아래 5%까지 빠르게 변화하는 포커싱 그래디언트를 기록합니다.

포커싱 그래디언트가 생성된 후 미처리 펩타이드 샘플 분리를 평가했습니다(그림 37A). 생성물 피크 직전에 작은 불순물 피크가 용리되었으나 거의 검출되지 않았습니다. 로딩은 2배(그림 37B, 72μg)일 때 불순물이 보다 잘 드러났지만, 주 피크는 여전히 비교적 순수한 상태였습니다. 기존 로딩 36μg의 4배에서는 불순물이 더 뚜렷한 크로마토그램을 생성했으며, 이 로딩이 분취를 위해 기하학적으로 더 큰 컬럼으로 스케일링업될 경우 순수 생성물을 얻을 확률을 감소시킬 가능성이 가장 높았습니다(그림 37C). 분석 컬럼에 256μg을 로딩할 경우, 불순물이 주 피크와 완전히 동시에 용리되었습니다(그림 37D).

분취 스케일로 스케일업

분취로의 기하학적 스케일업을 위해 분석 컬럼으로의 로딩량을 72μg로 선택했습니다. 이러한 보수적 로딩은 최소 주입 부피를 조정하는 것보다 더 적은 주입 부피로 합리적인 양의 순물질을 얻을 수 있는 확률을 높여줄 것입니다. 질량 로딩은 컬럼 부피에 비례하며, 분취용 계산기를 사용하거나 다음 방정식에서 M2에 대한 풀이법을 사용하여 결정됩니다. 여기서:

M1은 컬럼 1의 질량 로딩이며, M2는 컬럼 2의 질량 로딩입니다
L1은 길이이고 d1은 컬럼 1의 직경이고, L2는 길이이고 d2는 컬럼 2의 직경입니다

M2 = M1 X L2 / L1 X d2² / d1²
M2 = 72μg X 100mm / 50mm X (19mm)² / (4.6mm)²

M2 = 72μg X 36,100 / 1058
M2 = 2456μg 또는 2.4mg

미처리 펩타이드 44.03mg을 5mL DMSO에 용해시키고, 여과(농도 8.80mg/mL)하였습니다. 4.6 × 50mm 분석 컬럼의 72μg 로딩을 19 × 100 Prep 컬럼으로 스케일업하기 위해, 상기 계산한 대로 2.4mg의 주입량이 필요했습니다. 다음과 같이 8.80mg/mL의 미처리 펩타이드 농도로 주입 부피를 계산하였습니다.

주입 부피 = 2.4mg X 1mL / 8.80mg/mL
주입 부피 = 0.272mL 또는 272μL

분석 스케일과 분취 스케일의 시스템 부피를 고려하여, 분석 스케일 포커싱 그래디언트를 분취 스케일로 조정하였습니다(표 4). 분취 시스템의 경우 드웰부피(dwell volume)가 높은 것으로 보였지만, 컬럼 가열을 위한 5mL 예열 루프와 2mL 주입 루프가 포함되어 있었습니다. 시스템 부피에 대한 이러한 기여도를 고려할 때, 나머지 시스템 튜브에 기인하는 2.75mL는 상당히 합리적이었습니다. 생성물 피크는 시간별로 수집되었습니다(그림 38).

표 4. 그래디언트 스케일링.

• 컬럼: 4.6 × 50mm 컬럼: 19 × 100mm
• 시스템 드웰부피(dwell volume): 0.77mL 시스템 드웰부피(dwell volume): 9.75mL
• 컬럼 부피: 0.698mL 컬럼 부피: 23.804mL
• 시스템 드웰부피(dwell volume)(컬럼 내 부피): 1.10 시스템 드웰부피(dwell volume)(컬럼 내 부피): 0.41 그래디언트 오프셋: 0.66

분취물 분석

두 분취물로 수집된 펩타이드 생성물의 피크입니다. 이 두 가지 분취물은 그림 39와 같이 매우 순수하였습니다. 각각의 분취물 및 blank 분석에서 약 2.25분에 용리된 넓은 피크는 이동상의 저농도 이온쌍 트리플루오로 아세트산 변형제일 가능성이 가장 높습니다. TFA의 소수성 성분은 일반적으로 컬럼에 축적되었다가 그래디언트 과정에서 용리됩니다. 컬럼을 거치지 않은 또 다른 blank의 크로마토그램에서 피크가 나타나지 않았기 때문에 이 오염물질은 주입기 또는 밸브와 같은 시스템 요소에서 기인되지 않았습니다(그림 40).

At-Column Dilution(ACD)

펩타이드가 높은 순도로 분리되었음에도 불구하고, 주입당 샘플 로딩을 증가시키면 프로세스 효율성이 향상되고 후속 실험에 필요한 생성물 양을 정제하는 데 요구되는 크로마토그래피 실행 횟수가 감소할 것입니다. 앞서 논의한 바와 같이 At-Column Dilution(ACD)은 간단한 시스템 배관 변경을 통해 높은 샘플 로딩을 매우 효과적으로 관리합니다(그림 33).

At-Column Dilution(ACD)을 이용한 펩타이드 분리의 컬럼 부피당 %B의 변화율은 기존의 기하학적 스케일링 분리에 사용된 분석법과 동일하나, 보조 샘플 로딩 펌프에 의해 도입된 유기 용매의 기여도를 포함하도록 프로그램된 그래디언트 표를 수정하였습니다(표 5).

표 5. 그래디언트 비교: 기존 분석법과 At-Column Dilution 분석법.

그래디언트 시간: 14.40–1.66 = 12.74분 그래디언트 시간: 16.00–3.26 = 12.74분
그래디언트 부피: 12.74분 × 25mL/분 = 318.5mL 그래디언트 부피: 12.74분 × 25mL/분 = 318.5mL
컬럼 부피: 318.5mL × 1CV/23.804mL = 13.38CV 컬럼 부피: 318.5mL × 1CV/23.804mL = 13.38CV
그래디언트 기울기: 8%/13.38CV = 0.6%/CV 그래디언트 기울기: 8%/13.38CV = 0.6%/CV
그래디언트 중 로딩 펌프 유량 = 1.25mL/분
1.25mL/분 = 총 유량의 5%
총 그래디언트 분석법 유량 = 25mL/분

At-Column Dilution 펌프는 샘플 루프에 직접 유기 용매를 도입하며 총 유량의 5%에서 실행되도록 프로그래밍됩니다. 따라서 크로마토그래피 펌프의 유량은 기존 분석법의 25mL/분에서 At-Column Dilution 분석법에서 23.75mL/분으로 감소합니다. 총 유량은 여전히 25mL/분(23.75mL/분 + 1.25mL/분)입니다. At-Column Dilution 펌프는 주입기에 직접 배관되기 때문에 초기 조건의 홀드 단계가 샘플이 루프에서 컬럼으로 완전히 전달될 수 있을 만큼 충분히 길며, 그래디언트 시작 부분에 삽입됩니다. 이 시스템은 2mL 루프로 구성되며, 원래 홀드 단계는 0.66분입니다.

At-Column Dilution 분석법의 홀드 단계 계산: 2mL 루프 x (1분/1.25mL) = 1.6분
원래 분취법의 1.60분 + 0.66분 홀드 단계 = At-Column Dilution 분석법에 대한 2.26분 홀드 단계.

A와 B의 그래디언트 분석법 백분율 또한 At-Column Dilution 펌프의 기여도를 반영하도록 수정되었습니다. 포커싱 그래디언트는 5%B에서 시작하여 13%로 진행됩니다. At-Column Dilution 펌프에 의해 총 유량의 5%가 1.25mL/분의 일정한 이소프로판올 유량으로 전달되기 때문에 At-Column Dilution 분석법에서 B의 백분율은 각각 0%와 8%B로 프로그래밍됩니다. At-Column Dilution 분석법은 약간 다르게 프로그래밍되지만 실제 그래디언트는 기존 분석법과 동일합니다. 이 펩타이드는 B의 이렇게 낮은 비율에서 용리되기 때문에, At-Column Dilution 분석법의 5% B에서 실제 소요 시간은 더 길며, 기존 분취법의 0% B에서 5% B로 변경되는 시간이 At-Column Dilution 분석법에서 홀드 시간에 통합하게 됩니다. 이러한 두 단계는 명확하게 판독이 가능하도록 하기 위해 At-Column Dilution 분석법에서 별도의 라인에 프로그래밍됩니다. At-Column Dilution 펌프에서 전달되는 5%B를 고려하여 B의 백분율이 감소하므로, A의 백분율은 5% 증가하여 기존의 원래 주입 방법과 동일한 그래디언트를 유지해야 합니다. 크로마토그래피 시스템의 주입 시퀀스에 세척 단계가 있는 경우, 모든 세척 라인이 프라이밍되고 강력한 세척 용매로 채워지도록 해야 합니다.

40°C에서 기하학적으로 스케일링된 대량 분리를 실시하였으므로, At-Column Dilution을 이용하여 주입시 온도를 유지하였습니다. 용매 예열 루프는 수용성 용매 흐름의 티(Tee) 직전에 삽입하였습니다(그림 41).

용매 예열 루프, 티(Tee), 컬럼을 수조에 담갔습니다. 그래디언트 분리 과정을 시작하기 전에 압력이 안정되도록 하였으며, 이는 시스템 평형에 도달했음을 의미합니다. 기존의 배관 구성을 통해 최대 2.4mg의 펩타이드를 주입할 수 있는 반면, At-Column Dilution 구성의 시스템을 사용하면 컬럼에 그 5배인 12mg(1.36mL)을 주입할 수 있습니다(그림 42 및 43). 분취물은 시간별로 수집되었고, 이후 원래의 0–30%B 스크리닝 방법을 사용하여 분석했습니다. 분취물은 우수한 순도를 나타냈으며 기존의 주입 기법을 사용한 분취 과정으로 수집된 분취물과 대등했습니다(그림 44).

소수성 펩타이드의 특별한 고려사항

디메틸설폭사이드에 12개의 무극성 및 3개의 극성 아미노산 잔기로 이루어진 소수성 펩타이드를 용해시켰습니다. 기존 주입을 위해 배관된 19 × 100mm 컬럼 포함 크로마토그래피 시스템에서의 분리에 아래의 분취용 포커싱 그래디언트를 사용했습니다. 펩타이드의 소수성이 극히 높아 낮은 유량, 낮은 샘플 로딩 및 60°C의 온도를 사용해야 했습니다.

이 펩타이드는 At-Column Dilution을 사용하기 위한 좋은 후보이지만, 컬럼에 대한 질량 로딩이 증가하면 침전될 위험이 있습니다. 펩타이드가 약 50%의 아세토니트릴에서 용리되기 때문에, 이 샘플을 5% B로 로딩하는 것(이전 예시와 같이)은 필요한 용리 세기보다 훨씬 낮으므로 펩타이드가 희석될 경우 컬럼 헤드에서 침전될 가능성이 있습니다. 로딩 단계 중 크로마토그래피 펌프에서 나오는 유기 용매의 비율을 증가시키면 잠재적인 침전 문제가 완화됩니다. 일반적으로 극소수성 화합물의 경우, 예상된 화합물 용리율보다 20–25% 낮은 그래디언트 분석법으로 초기 유기 용매 비율을 사용할 경우 At-Column Dilution 기법의 이점을 유지하면서 샘플의 침전을 방지할 수 있습니다. 다음은 At-Column Dilution 그래디언트는 19 × 100mm 컬럼에 5배 더 큰 샘플을 로딩하는 데 사용된 그래디언트입니다(그림 45).

그래디언트는 48.6%B(At-Column Dilution 펌프에서 43.6%B + 5%B)에서 시작하여 기존 주입에 사용된 그래디언트 변화 속도와 동일한 0.49%의 컬럼 부피당 기울기로 29분 만에 53% 아세토니트릴로 종료되었습니다. At-Column Dilution 펌프는 100% 아세토니트릴에 용해시킨 펩타이드 샘플을 5mL 루프에서 티(Tee)까지 전달하였으며, 초기 조건인 23.6% B(At-Column Dilution 펌프에서 18.6%B + 5%B)에서 크로마토그래피 펌프 이동상으로 이동하였습니다. 해당 분석법을 시작할 때 9.2분 동안 유지한 결과, 샘플이 컬럼에 완전히 로딩되었습니다. At-Column Dilution 펌프는 0.8mL/분의 일정한 유량으로 작동하며, 이는 총 유량 16.3mL/분의 5%에 해당합니다.

모든 컬럼은 저분자 분리 또는 고분자 분리에 사용되는 모든 경우에 주기적인 세척이 필요합니다. 따라서 샘플과 무관하게 높은 역압, 높은 크로마토그래피 백그라운드 및 외인적 피크가 나타나면 이는 컬럼 세척이 필요함을 의미합니다.

컬럼에 오염물질이 쌓이지 않도록 하는 것이 컬럼 수명을 연장하는 가장 좋은 방법입니다. 주입 전에 모든 샘플을 여과시키는 것이 좋습니다. 컬럼 앞에 인라인(In-line) 필터 또는 가드 컬럼을 추가하면 미립자 및 기타 원하지 않는 여러 혼합물 성분을 수집하는 데 도움이 됩니다. 각 분리 후 높은 비율의 유기 용매를 컬럼 부피의 2-3배 양으로 컬럼에 통과시켜 세척하면 원치 않는 오염물질을 효과적으로 제거할 수 있습니다. 마지막으로, At-Column Dilution은 샘플을 용액에 유지시키므로 고압 셧다운이 방지되고 최종 목적지가 분취용 수집 튜브이든 폐기통이든 상관 없이 샘플 성분을 정제 시스템에 효과적으로 통과시킬 수 있습니다.

갑자기 높은 역압이 발생하면 샘플 루프, 튜브, 컬럼 또는 검출기 플로우 셀 등 시스템의 어디에선가 샘플이 침전되었을 가능성이 높습니다. 크로마토그래피 시스템을 펌핑할 경우, 폐기물 라인에서 시작하여 펌프 쪽으로 돌아가면서 HPLC 피팅을 천천히 풀어주면 고압의 원인이 확실하게 구분될 것입니다. 역압이 점진적으로 증가하는 것은 아마도 여러 번의 주입 후 컬럼에 불순물이 축적된 결과일 것이며, 이는 여러 가지 다른 방법으로 해결할 수 있습니다. 고온에서 반복적으로 빠르게 그래디언트를 수행하거나, 높은 비율의 유기 용매에 장시간 동안 컬럼을 세척하거나, DMSO 또는 1–10% 포름산과 같은 ‘세척 용매’를 주입하는 방법 모두가 컬럼 내의 원치 않는 오염물질을 제거하는 데 이용될 수 있습니다(그림 46).

최종 생성물을 오염시키고 알레르기 반응을 유발할 수 있는 내독성 다당류를 컬럼에서 제거하는 과정인 발열성 물질 제거(Depyrogenation)를 위해서는 일반적으로 1M의 수산화나트륨으로 1시간 이상 강세척해야 합니다. 현재 컬럼에서는 이 절차를 적용할 수 없습니다.