펩타이드 분리를 위한 실용적 접근 방식
소개
펩타이드는 신약 후보 개발에서 고유한 역할을 하며 기존의 저분자 치료법과 거대 단백질 치료제 간의 빈틈을 전문적으로 공략할 수 있는 기회를 줍니다. 펩타이드는 저분자에 비해 인체에 대한 효율성, 안전성, 내약성이 높고, 단백질 기반 바이오 의약품보다 생산 복잡성과 비용이 낮기 때문에, 많은 의학적 상태를 표적으로 하는 잠재적 약물 후보로서 점차 관심의 대상이 되고 있습니다. 합성 펩타이드는 세포 기질 간의 구조-활성도 관계를 연구하는 데 사용하거나 약물 자체로서 효과적일 수 있습니다. 펩타이드가 고체상 펩타이드 합성, 용액상 합성, 또는 천연 소스로부터 분리되어 단계적으로 제조되는 모든 경우에 대부분의 미처리 펩타이드 혼합물은 복잡하며 정제 과정이 요구됩니다. 합성 반응을 세심하게 제어하더라도 불순물은 불가피하게 형성되며 결실, 절단, 또는 분해 부가물이나 프로세스 중 형성된 여러 부산물을 포함하여 화학적으로 변형된 서열을 포함할 수 있습니다.
최근 몇 년 동안 이루어진 분석법의 기술적 발전은 진단 및 새로운 치료법으로서 펩타이드가 보급되는 데도 영향을 미쳤습니다. 첨단 기기에서 수행되는 분석법은 더 짧은 시간 내에 향상된 감도와 더 높은 분리능을 보여주며, 이 두 가지 모두 생산 중 중요한 시간 절약으로 이어집니다.
합성 펩타이드는 분리 방법 개발에 있어 고유한 과제를 제기합니다. 향후 연구에서 순도와 표적 펩타이드 수율은 실험 결과에 영향을 미치는 중요한 요인입니다. 상기 언급한 바와 같이, 합성 펩타이드의 합성, 절단 및 탈보호에 따른 불순물의 수치는 상당히 높을 수 있습니다. 분석 HPLC와 관련된 분석법 개발 원리를 적용함으로써 펩타이드 생성물의 분리를 개선할 수 있습니다. 대량 분취 과정에서 정제법을 만들기 위해 사용되는 분리 메커니즘은 소량 분리에서 이용되는 원리와 동일합니다. 컬럼 선택, 이동상 변형제 선택, 온도 사용 및 그래디언트 최적화는 분리 방법 개발에서 검토되어야 하는 부분들입니다. 펩타이드 분리를 위한 체계적인 분석법 개발로 생성물의 순도와 수율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 기존의 펩타이드 분리에 일반적으로 UV에 의한 크로마토그래피가 사용되지만, 신중한 분석법 개발과 함께 질량에 의한 분리 방법을 이용하면 표적 펩타이드와 합성 및 절단 과정에서 형성된 오염물질을 보다 효과적으로 분별하고 정제 과정을 보다 간소화할 수 있습니다.
펩타이드 정제 프로세스 요건
분리 전략의 목표는 후속 실험을 수행하는 데 필요한 순도로 가능한 한 짧은 시간 내에 샘플을 정제하는 것입니다. 여러 가지의 펩타이드를 합성하는 일반적인 실험실의 경우, 필요할 때 간단한 최적화를 적용하면서 대부분의 샘플에 사용할 수 있는 표준 정제 프로토콜을 수립하는 것이 유용합니다. 실행 사이의 일관된 성능과 함께 이동상 조성, 변형제 또는 컬럼 온도의 변화를 이용하면 분리를 위해 여러 컬럼 세트를 사용하지 않아도 됩니다. 수율 및 순도를 개선하기 위한 이러한 경제적인 방법은 간단하고 구현하기 쉽습니다. 최적의 펩타이드 정제 프로세스에는 또한 분석 및 분취 스케일에서 분리를 실행할 수 있는 견고한 기기를 사용할 수 있습니다. 유량 범위가 넓은 다용도 기기에서 분리에 적절한 크기의 컬럼 직경으로 컬럼을 변경하는 것만으로도 정제의 효율성이 개선됩니다. 이 모든 요소들을 함께 고려하면 펩타이드 정제와 관련된 전반적인 비용을 줄일 수 있습니다.
펩타이드 분리 워크플로우
표준 펩타이드 분리 프로토콜(그림 1)은 후속 실험 수행에 얼마나 많은 순수 펩타이드가 필요한지를 정의하는 것으로 시작합니다. 미처리 펩타이드를 분석하면 샘플 순도를 합리적인 수준에서 추정할 수 있으며, 이후 연구에 필요한 정의된 양의 순수 펩타이드와 결합하여 예상되는 질량 로딩을 계산할 수 있습니다. 질량 로딩에 따라 분취용 컬럼 크기가 결정되고, 이에 따라 선택한 LC 기기에 필요한 유량이 정의됩니다.
그림 1. 펩타이드 분리 워크플로우.
미처리 펩타이드를 분석한 후, 분리를 위해 동일한 케미스트리의 더 큰 컬럼으로 스케일링합니다. 그림 2의 스케일링 수식은 한 컬럼 크기에서 다른 컬럼 크기로 분리를 스케일링하기 위한 컬럼 직경, 컬럼 길이, 질량 로딩 및 유량 사이의 관계를 보여줍니다. 그래디언트 기울기를 단위 시간당 변화율(%) 대신 컬럼 볼륨당 변화율(%)로 표현하면 초기 조건에서 최종 조건까지 각 그래디언트 분석법 단계에 대해 동일한 수의 컬럼 부피를 전달하여 분리능을 유지하는 데 도움이 됩니다. 분취법에는 시스템 지연을 모방하기 위한 시작 조건의 초기 홀드가 포함되어야 하며, 이는 소량 분리에서 관찰되는 컬럼 부피의 수로도 표현됩니다. 분취용 크로마토그래피가 완료되면 수집된 분취물이 분석적으로 평가됩니다. 이후 사용자 가이드라인에 규정된 대로 순수 펩타이드가 처리됩니다.
그림 2. 스케일링 수식.
펌프, 주입기, UV 검출기 및 분취용 수집기로 구성된 가장 간단한 액체 크로마토그래피 시스템은 펩타이드 분리에 완벽하게 적합합니다(그림 3). 질량 검출은 펩타이드 분리에는 필요하지 않지만 펩타이드 표적을 식별하고 분리 후 분석이 필요한 수집 분취물의 수를 줄입니다. 이온화되지 않거나 잘 이온화되지 않는 화합물은 종종 낮은 파장의 UV로 검출됩니다. 반대로, UV 소광이 매우 낮은 펩타이드는 일반적으로 MS를 통해 쉽게 검출됩니다.
그림 3. 염기성 액체 크로마토그래피 시스템 도표.
정제 프로세스 고려사항
분리 모드
펩타이드마다 특성이 매우 다양하기 때문에 분리를 위한 크로마토그래피 모드도 다양합니다. 역상 크로마토그래피는 지금까지 펩타이드 정제를 위해 가장 많이 사용되는 모드이지만, 일부 펩타이드들은 이온 교환 또는 크기 배제와 같은 대체 선택성을 사용하여 보다 효율적으로 분리됩니다. 이러한 대체 기법은 역상과 결합하여 난해한 샘플을 처리하기 위한 2단계 프로세스를 구성할 수도 있습니다.
역상
재현성과 넓은 적용 범위 덕분에 역상 크로마토그래피는 펩타이드를 포함한 많은 종류의 화합물의 분리에 일반적으로 사용됩니다. C18-결합 실리카는 가장 많이 사용되는 역상 컬럼 충전재 유형 중 하나로, 무극성입니다. 일반적으로 아세토니트릴이나 메탄올과 같은 혼화성 극성 유기 용매의 수용액으로 구성되는 역상 이동상은 C18 컬럼에서 해당 극성에 따라 화합물을 용리시킵니다. 따라서 펩타이드의 소수성이 클수록 C18 컬럼에서 더 오래 머무르게 됩니다.
C18은 가장 많이 사용되는 역상 충전재이지만, 다른 리간드(C4, C8, RP18, 페닐 등)도 염기 입자에 결합되어 화합물의 분리를 최적화하기 위한 대체 선택성을 제공할 수 있습니다. 실리카는 역상 충전재로 사용된 첫 기질 중 하나였지만, 실리카계 충전재는 분리 속도, 분리능, pH, 온도 및 컬럼 로딩 용량에서 제약이 따릅니다. 새로운 컬럼 기질 개발에 사용되는 특허 받은* 하이브리드 입자 기술은 선택성, 분리능, 재현성, 컬럼 수명을 향상시키면서 보다 개선된 속도, 온도, pH에서 작업할 수 있는 입자를 만들어냅니다.
*미국 특허 번호 6,686,035 B2
이온 교환
이온 교환 크로마토그래피는 단백질과 여러 생물제제의 분리를 위해 오랫동안 사용되어 왔습니다. 펩타이드의 아미노산은 양전하를 띠거나 음전하를 띠기 때문에, 이온 교환 크로마토그래피를 펩타이드 분리에 이용할 수 있습니다. 아가로스, poly(methyl methacrylate) (MMA) 같은 합성 폴리머, 또는 폴리스티렌 디비닐벤젠과 같은 기능화된 천연 고분자 레진은 대량 응용 생물학적 제법에서 프로세스와 배치 사이에 이루어져야 하는 철저한 세척 조건을 견딜 수 있기 때문에 일반적으로 고분자 분리용 미디어로 사용됩니다. 이러한 과정에서 사용되는 수산화나트륨 용액은 일반적으로 저분자 및 소량의 펩타이드 분리에 사용되는 실리카계 물질에 유해합니다.
이온 교환기에는 약한 음이온, 약한 양이온, 강한 음이온, 강한 양이온의 네 가지 유형이 있습니다. 양이온 교환은 음전하 표면에서 양전하를 띤 이온을 유지하고 분리하는 데 사용되고, 음이온 교환은 음전하 표면에서 음전하를 띤 이온을 유지하고 분리하는 데 사용됩니다. 강한 음이온과 양이온 교환 컬럼은 넓은 pH 범위(2–12)에서 완전히 이온화되는 반면, 약한 이온 교환 컬럼은 좁은 pH 범위(9.5–5.5)에서 전하를 띠게 됩니다.
양이온 교환을 이용한 펩타이드 분리가 음이온 교환보다 더 일반적이지만, 실제로는 펩타이드 서열에 따라 사용할 모드가 결정됩니다. pH 3 이하에서 수행되는 펩타이드 분리의 경우, 아미노산성 곁사슬 카르복실기의 음전하가 중성화되고, N 말단기가 양성자화되어, 펩타이드가 양전하를 띠게 되고 양이온 교환 컬럼의 음전하 부위로 끌립니다(그림 4).
그림 4. 양이온 교환 컬럼 충전재로의 펩타이드 끌림.
반대로, pH 6~10 사이의 분리에 더 적합한 펩타이드의 경우, 음이온 교환이 사용될 수 있습니다. 높은 pH에서 음이온 교환의 경우, 펩타이드의 카르복실기가 음전하를 띠어 음이온 교환 컬럼의 양이온 부위로 끌립니다(그림 5).
그림 5. 음이온 교환 컬럼 충전재로의 펩타이드 끌림.
이온 교환을 이용한 펩타이드 분리를 위해 컬럼을 선택하고 분석법을 개발할 때 몇 가지 일반적인 권장이 제공될 수 있습니다. 음이온 또는 양이온 교환을 사용할 수 있습니다. 일반적인 출발점으로, 산성 펩타이드는 음이온 교환에서 분리하고, 염기성 펩타이드는 양이온 교환에서 분리합니다. 이러한 선택은 일부 펩타이드, 특히 거대 펩타이드에서 효과적으로 반전될 수 있지만, 순전하가 충전재와 반대가 되도록 pH를 조정해야 합니다.
두 극성 모두의 경우에 펩타이드 크로마토그래피에 강한 교환기가 바람직합니다. 펩타이드의 전하는 전하를 띠는 곁사슬 주위의 서열과 미세 환경의 함수입니다. 이동상 pH를 약간만 조정하여 특정 펩타이드 서열에 따라 분리 선택성을 조절할 수 있습니다. 선택성에 대한 이러한 작은 조정은 강한 이온 교환기의 결합력에 영향을 미치지 않습니다.
이동상 및 작동 조건을 선택할 때는 이온 교환 분리가 2-단계 정제의 첫 번째 단계로 계획되었는지, 혹은 실험 물질을 생성하는 단일 분리 단계로 계획되었는지를 고려해야 합니다. 이온 교환에서 수집된 물질을 역상으로 추가 정제해야 하는 경우, 단백질 이온 교환에 대한 일반적인 방식에 따라 완충액와 용리 조건을 결정할 수 있습니다. 인산염 또는 트리스 완충액을 사용하고 염화나트륨의 그래디언트를 통해 용리하는 예를 들 수 있습니다. 이어지는 단계에서 염이 생성물에서 제거됩니다.
단일 단계에서 사용 가능한 펩타이드를 생성하기 위해 이온 교환을 선택하는 경우, 동결건조로 제거할 수 있는 휘발성 완충액을 선택하는 것이 현명합니다. 우선 포름산암모늄을 선택하는 것이 좋은데, 여기에는 암모늄과 포름산의 pK에 해당하는 두 개의 완충 영역이 있기 때문입니다. 염기성 펩타이드의 양이온 교환 크로마토그래피의 경우 pH 3에서 pH 4까지, 산성 펩타이드의 음이온 교환 크로마토그래피의 경우 pH 9.25에서 pH 10.25까지 사용할 수 있습니다. 용리는 일정한 pH에서 포름산암모늄 농도를 증가시키는 이온 세기 그래디언트의 영향을 받을 수 있습니다. 또는, pH 그래디언트를 통한 용리는 높은 이온 세기 완충액으로부터 시간 소모적인 동결건조 과정을 줄여줍니다. 다시 말하지만, 포름산암모늄 완충액은 좋은 출발점을 제공합니다. 음이온 교환 컬럼에서 산성 펩타이드는 높은 pH에서 낮은 pH의 순서로 용리되고, 양이온 교환 컬럼에서 염기성 펩타이드는 낮은 pH에서 높은 pH의 순서로 용리됩니다.
크기 배제
오늘날 크기 배제 크로마토그래피(SEC)라고 불리는, 크기에 기초한 분자의 크로마토그래피 분리의 역사는 1950년대로 거슬러 올라갑니다. 전하나 극성과 같은 화학적 성질이 아닌 크기에 기초한 분자의 분리는 역사적으로 겔 여과 또는 겔 투과 크로마토그래피(GPC)라고도 알려져 왔습니다. 공극 크기 분포가 정의된 고정상 입자는 컬럼 베드의 기공보다 큰 샘플 분자를 배제시켜 매우 빠르게 용리되도록 하는 반면, 저분자는 공극으로 들어가 더 길고 복잡한 경로를 거쳐 용리됩니다. 따라서 고분자가 먼저 용리되고 저분자는 용액에서 크기가 작아지는 순서대로 용리됩니다(그림 6). SEC는 등용매법을 사용하는 저분리능 기법으로, 실행 사이에 평형화가 필요하지 않습니다. 컬럼 로딩은 샘플 부피와 농도에 따라 달라지며, 둘 모두 분리능에 영향을 미칩니다.
그림 6. 크기 배제 크로마토그래피 샘플 용리.
SEC는 때로 결절된 서열, 불완전한 탈보호의 펩타이드 및 기타 불순물을 제거하기 위한 초기 정제 단계로 사용됩니다. 합성 펩타이드의 길이가 증가함에 따라 이러한 오염물질의 수가 상당할 수 있습니다. 역상으로 분리하기 전에 간단하게 초기 정제 단계를 거치면 크로마토그래피 복잡성이 줄어듭니다. SEC는 완충액 교환, 즉 펩타이드가 현재 용해되어 있는 완충액을 다음 실험 또는 정제 단계에 더 적합한 다른 완충액 또는 용액으로 변경하는 데에도 사용될 수 있습니다.
요약
펩타이드는 역상, 이온 교환, 크기 배제를 포함한 많은 다양한 크로마토그래피 기술을 사용하여 분석하고 분리할 수 있습니다. 반분취 스케일에서 사용되는 분석법(분리 스케일의 경우 몇 밀리그램에서 수백 밀리그램)은 일반적으로 역상입니다. 펩타이드 분리에 대한 나머지 논의에서는 역상 크로마토그래피를 사용하여 펩타이드 분석과 정제를 최적화하는 데 사용할 수 있는 요인과 기술에 대해 다룰 것입니다.
