펩타이드 분리를 위한 실용적 접근 방식

기존의 펩타이드 분리는 일반적으로 UV 검출을 사용하여 수행되지만, 질량에 의한 분리는 합성 및 절단 과정에서 형성된 표적 펩타이드와 오염물질 간의 모호한 차이를 줄여주어 정제 과정을 보다 간편하게 합니다. 질량 검출은 복잡한 크로마토그램에서 피크 식별성과 균질성을 평가하고 샘플 처리량을 증가시키는 데 사용될 수 있습니다. 질량 검출과 UV 검출 모두를 포함하는 분리를 개발하면 보다 완전한 크로마토그래피 샘플 프로파일을 생성할 수 있습니다. 이온화되지 않거나 잘 이온화되지 않는 화합물은 종종 낮은 파장의 UV로 검출됩니다. 반대로, UV 소광이 매우 낮은 펩타이드는 일반적으로 MS를 통해 쉽게 검출됩니다.

용매

아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등 펩타이드 분리에 일반적으로 사용되는 용매는 모두 전기 분무법(ESI) 및 기타 대기압 이온화 기법과 호환됩니다. 그러나 일반적으로 아세토니트릴이 최고의 분리능, 선택성, 피크 대칭성, 효율성을 제공합니다. 또한 아세토니트릴의 점도가 낮으므로 크로마토그래피 분리에 사용할 경우 LC 시스템의 역압을 감소시킵니다. 휘발성뿐만 아니라 용매의 양성자 공여 성질 모두 ESI에 중요합니다. 휘발성 유기 용매는 MS 소스에 형성된 액적의 표면 장력을 감소시켜 이온화 과정을 촉진하고 감도를 증가시킵니다. 많은 펩타이드가 포름산 또는 트리플루오로 아세트산(TFA)과 같은 산성 변형제를 사용하여 분석되고 분리되지만, TFA는 이온화를 어느 정도 억제합니다. 분석법 개발에 양성자-음전자 전환이 필요한 경우, 초산암모늄 또는 포름산암모늄 이동상을 사용할 수 있으며, MS 친화적인 선택입니다. 높은 pH에서 더 잘 분리되는 펩타이드의 경우, 탄산수소 암모늄을 포함한 이동상이 적합합니다. 질량 검출기에서 침전 가능성을 줄이기 위해 20mM 이하의 농도에서 휘발성 완충액을 사용해야 합니다.

검출 관리하기

분취 크로마토그래피에서는 검출에 대한 특별한 고려사항이 요구됩니다. 고농도 피크는 대부분의 검출기가 가진 선형 범위를 초과하며, 고유량은 검출기 하드웨어와 호환되지 않습니다. MS와 ELSD와 같은 일부 검출기는 파손될 수도 있습니다. 따라서 샘플 손실을 줄이면서 검출기에 도달하는 유량과 농도를 효율적으로 낮출 필요가 있습니다. 수동 유량 분할기는 일반적으로 샘플이 검출기에 도달하기 전에 샘플을 분할하고 희석하는 데 사용됩니다(그림 47 및 48). 보충 용매는 분취 흐름 샘플링을 희석하여 검출기로 전달합니다.

수동 분할기는 특정 크로마토그래피 유량 범위 및 분할 비율로 사용하도록 제작됩니다. 분할기의 유체는 선택한 컬럼에 적합한 유량과 일치해야 합니다. 보다 높은 분할 비율은 피크가 높은 농도로 용리될 때 사용됩니다. 일반적으로 사용되는 유량 분할기와 그 분할 비율을 표 6에 나타내었습니다.

표 6. Waters에서 제공하는 수동 분할기.

수동 유량 분할기의 대안으로 이용되는 능동 분할기는 프로그래밍된 분할 비율에 상응하는 속도로 분취 흐름을 기계적으로 샘플링합니다. 그런 다음 샘플링된 스트림은 희석되어 보충 용매에 의해 검출기로 전달됩니다. 그러나 능동 분할기는 베이스라인을 불안정하게 만드는 경우가 많으며, 기계적 마모로 인해 성능이 자주 저하됩니다. 수동 유량 분할기와 능동 유량 분할기 모두 분취 스트림을 샘플링하는 데 동일하게 효과적이기 때문에 사용되는 분할기의 유형은 사용자 선호도에 따라 달라집니다.

변형제

특정 이동상 및 변형제는 분리하는 펩타이드의 용도에 따라 선택됩니다. 앞서 설명한 바와 같이, 이동상 변형제는 pH를 높이거나 낮추어 펩타이드의 이온화 특성을 조절하는 첨가제입니다. 또한 펩타이드의 하전된 곁사슬 및 말단과 이온쌍을 형성하여 샘플의 소수성을 증가시킬 수도 있습니다. 일반적으로 트리플루오로 아세트산이 이러한 목적으로 사용됩니다.

이온쌍은 펩타이드와 소수성 컬럼 고정상의 상호작용을 증가시키고, 그 결과, 일반적으로 분리 품질이 향상됩니다. 안타깝게도, TFA로 형성된 강한 이온쌍은 전기 분무 이온화에 사용되는 조건으로는 쉽게 분해될 수 없습니다. 결과적으로, 이온화되는 펩타이드 분자의 수가 줄어들고 신호 세기가 감소합니다. 이상적으로 가장 적합한 변형제는 크로마토그래피 분리를 개선하기 위해 이온쌍을 형성하지만 전기 분무 이온화를 불안정하게 하지 않는 변형제일 것입니다.

Apffel, 등은 분석물과 쌍을 이루기 위해 TFA와 경쟁할 수 있는 약산을 포스트 컬럼에 추가하는 방법을 제안했습니다. TFA가 양성자화되도록 경쟁을 유도할 수 있을 정도로 높은 농도의 약산을 이용하여 양성자화된 TFA를 증발시키고 분석물질을 보다 효율적으로 이온화시킬 수 있습니다. MS 신호의 감도와 세기는 증가합니다. 이를 위해 여러 농도의 많은 산이 사용될 수 있지만, 질량에 의한 정제에서 보충 용매로서 1:1 물/유기 비율의 0.1% 프로피온산이 잘 사용되고 있습니다.

단일 동위원소 질량 vs. 평균 질량

질량에 의한 정제는 펩타이드 표적의 분리에서 모호성을 줄여주지만, 분취 트리거에 어떠한 질량을 사용해야 하는지 고려하는 것이 중요합니다. 대부분의 저분자 분리에서, 단일 동위원소 질량은 식별을 위해 사용되는 주된 질량이고, 관련된 다른 이온 부가물들은 이 값에 기초하여 정의되고 모니터링됩니다. 펩타이드와 같은 고분자의 경우, 때로 평균 질량이 주요 식별자로 사용됩니다.

단일 동위원소 질량은 분자 내 각 원소의 가장 많은 동위원소 질량을 사용하여 계산되는 반면, 평균 질량은 분자 내 각 원소의 모든 천연 동위원소의 가중 평균을 사용하여 계산됩니다. 결과적으로, 펩타이드의 경우, 평균 질량은 단일 동위원소 질량보다 현저히 클 수 있습니다. 분자 내 탄소의 수가 증가할수록 13_C가 더 많이 존재할 가능성이 커지며, 이는 결국 분자량을 증가시킬 것입니다.

또한, 단일 동위원소 질량은 질량 스펙트럼에서 가장 강도가 높은 피크가 아닐 수 있습니다. 단일 동위원소 질량 또는 평균 질량을 사용해야 하는 경우를 정의하는 규칙은 없지만, 1500–1700 분자량 범위가 일반적으로 펩타이드 트리거에 평균 질량을 사용하는 분기점입니다. 실제로, 사용 가능한 많은 소프트웨어 프로그램은 펩타이드 전하 상태에 대한 평균 및 단일 동위원소 m/z를 모두 계산합니다. 두 가지 대안을 모두 트리거로 포함하는 것이 가장 적합합니다. 트리거에 대한 최상의 선택은 분리 전 스크리닝 실행 중에 분명해집니다.

전하 상태

극단적이지 않은 조건에서 샘플을 이온화하고 다중 전하를 가진 분자를 생성하는 기법인 전기 분무법은 질량에 의한 정제에 자주 사용됩니다. 일부 펩타이드는 분석기의 질량 상한보다 높은 분자량을 가질 수 있지만, m/z 값이 낮은 다중 하전된 이온은 일반적으로 분광계의 질량 범위 내에 들어옵니다. 용액 pH, 산성 및 염기성 작용기의 수, 분석에 사용된 용매의 물리적 특성 등 여러 가지 요인이 펩타이드의 전하 상태에 영향을 미치게 됩니다.

앞서 논의한 바와 같이, 펩타이드 분리 과정은 대개 분석과 함께 시작됩니다. 분자량과 가능한 전하 상태가 계산되어 펩타이드 생성물을 보다 쉽게 식별할 수 있습니다. 미처리 샘플 프로파일은 분리능을 개선하여 순수 생성물을 보다 잘 분리하는 데 필요한 분석법 개발의 범위를 나타내지만, 분석은 또한 전하 상태에 대한 정보도 드러내줍니다. 그림 49에 나타낸 미처리 분석의 총 이온 크로마토그램에서 도출된 질량 스펙트럼을 고려해 보겠습니다. 계산된 펩타이드 질량은 1772.9였으며, 양전하를 띤 이온(1773.9)이 존재하였지만, 매우 소량이었습니다. 887.8에서 이중 하전된 이온은 지금까지 가장 높게 존재하는 이온입니다. 소량의 삼중 하전된 이온(592.3)과 불순물(781.2)도 적은 양으로 존재합니다. 질량 스펙트럼에 다중 하전된 이온이 존재함에도 불구하고, 펩타이드는 크로마토그램에서 하나의 피크로 나타납니다. 추출된 이온 크로마토그램에서 이중 및 삼중 하전된 피크가 동시에 용리될 수 있습니다(그림 50).

분취용 수집 트리거

펩타이드가 다중 하전된다는 사실 때문에 종종 주어진 MS 실험에서 가장 풍부한 화학종을 예측하기가 어려워집니다. 따라서 질량에 의한 정제를 통한 펩타이드 분리에 사용되는 분취 트리거에는 예상되는 다중 하전 이온이 모두 포함되어야 합니다.

데이터 수집: Continuum vs. Centroid

펩타이드 샘플의 복잡성, 다중 전하 상태의 확률, 및 펩타이드 길이가 증가함에 따라 단일 동위원소 질량 또는 평균 질량을 사용하는 대안 때문에 MS 데이터는 continuum 모드로 수집되어야 합니다. Continuum 데이터는 질량 축에서 확인된 모든 포인트의 관측된 세기를 나타냅니다. 여기에는 특정 세기의 m/z를 측정할 때의 통계적 부정확성이 포함됩니다. 그러면 이 원시 신호를 처리하여 겹칠 수 있는 각 질량 신호의 세기를 얻을 수 있으며, 이를 통해 매우 유사한 m/z를 구별할 수 있습니다. Centroid 데이터는 질량 스펙트럼의 각 이온 분포에 대한 하나의 중심 데이터 포인트를 표시하기 위해 처리된 continuum 데이터이며 질량 스펙트럼에서 막대로 표시됩니다(그림 51).

질량에 의한 펩타이드 분리 예시

다음의 두 펩타이드는 Research Genetics, Inc.(Huntsville, AL, U.S.)의 Kelly Wasmund 박사가 제공한 것으로, 논의된 원리에 따라 질량에 의한 정제로 분리되었습니다.

• NH2-ISQAVHAAHAEINEAGR-COOH(ISQA로 약칭)
• NH2-SIINFEKL-COOH(SIIN로 약칭)

각 펩타이드를 0.5mL 디메틸포름아마이드(DMF)에 개별적으로 적신 후 물에 5.0mL로 희석하였습니다. ISQA의 농도는 5–10mg/mL, SIIN은 10mg/mL로 추정되었습니다. 각 펩타이드의 소량 분리에 대한 조건은 표 7에 제시되어 있으며, 크로마토그래피와 스펙트럼 결과는 각각 그림 52와 53에 제시되어 있습니다. ISQA와 SIIN의 다양한 전하 상태에 대해 계산된 표적 이온은 표 8과 같습니다.

소량
용매 A: 0.1% TFA 수용액
용매 B: 0.1% TFA 아세토니트릴 용액
주입 부피: 40µL
컬럼: 4.6 × 50mm Symmetry 300, C_18, 5µm

대량
용매 A: 0.1% TFA 수용액.

용매 B: 0.1% TFA 아세토니트릴 용액
주입 부피: 5mL
컬럼: 30 × 150mm Symmetry 300, C_18, 7µm
표적 질량: (ISQA) [M+H]⁺ = 1773.9, [M+2H]²⁺ = 887.5, [M+3H]³⁺ = 592.2, [M+4H]⁴⁺ = 447.2
표적 질량: (SIIN) [M+H]⁺ = 963.5, [M+2H]²⁺ = 482.3, [M+3H]³⁺ = 321.9

표 7. ISQA와 SIIN의 소량 분리에 사용되는 그래디언트 조건.

표 8. ISQA와 SIIN의 다양한 전하 상태에 대해 계산된 표적 이온.

van Deemter 곡선에 대한 이해

각 펩타이드에 대한 포커싱 그래디언트는 표적 펩타이드와 근접하여 용리되는 오염물질 사이의 분리능을 향상시키도록 설계되었습니다. ISQA에 대한 분취용 포커싱 그래디언트는 12%B에서 시작하여 20%B까지 진행되었으며, 펩타이드는 대략 17%B에서 용리되었습니다(표 9 및 그림 54). 마찬가지로, SIIN에 대한 분취용 포커싱 그래디언트는 23%–31%B 범위였으며, 생성물은 대략 28%B에서 용리되었습니다(표 10과 그림 55). 분취 수집을 위한 질량 트리거에는 예상되는 다중 하전 이온이 포함되었습니다(표 8).

van Deemter 곡선에 대한 이해

표 9. ISQA의 정제에 사용되는 포커싱 분취 그래디언트.

표 10. SIIN의 정제에 사용되는 포커싱 분취 그래디언트.

분취 실행에서 발생하는 분취물은 순도를 평가하기 위해 분석되었습니다. 분취물을 완전하게 특성화하기 위해 여러 검출 채널을 이용해 분석을 모니터링했습니다. ISQA와 SIIN 펩타이드의 분취 분석은 미처리 펩타이드 분석에 사용된 것과 동일한 그래디언트 분석법으로 실행되었습니다. ISQA와 SIIN에 대한 결과는 그림 56과 57에 각각 제시되어 있습니다.

결론

펩타이드는 합성, 약물 설계, 발견 및 개발, 제조를 위한 새로운 기술의 힘을 빌어 치료 분야에서 중요한 간극을 메우고 있습니다. 기술적 변화에도 불구하고, 펩타이드 분리의 기초 원리는 일관되며, 많은 프로세스에서 UV 및 질량 검출과 역상 HPLC의 조합이 이용되고 있습니다. 빠른 그래디언트를 통해 미처리 펩타이드를 분석하고, 그래디언트를 포커싱하며, At-Column Dilution을 통해 더 큰 컬럼으로 스케일링하고 온도를 제어하는 방법은 표적 펩타이드를 신속하게 분리하는 효과적인 수단입니다. UV 검출은 펩타이드 분리에 널리 사용되지만, 질량에 의한 정제는 수집되는 분취물 수와 후속 분취물 분석에 요구되는 시간을 단축시킵니다. 분할 및 희석 기술을 사용하여 검출기 신호를 제어하고 적절한 크로마토그래피 이동상, 변형제 및 보충 용매를 사용하며, 분취 트리거를 위한 합리적인 전하 상태를 선택하면 펩타이드 정제 프로토콜을 간소화할 수 있습니다.