SPE 입문자 가이드

SPE는 크로마토그래피입니다

고체상 추출법은 HPLC와 동일한 기반을 가지고 있다는 점을 유념해 주십시오. 관심 분석물의 크로마토그래피 거동 및 기타 매트릭스 성분에 대한 지식은 적절한 Sorbent와 용리액을 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 특정 크로마토그래피 조건이 분석물을 간섭물질로부터 잘 분리할 수 있다는 것을 알고 있다면 유사한 SPE Sorbent와 용매 조합을 선택할 수 있습니다. 마찬가지로 HPLC에서 함께 용리되는 간섭물질을 제거하려는 경우 유사한 SPE 조건이 성공하지 못할 것이라는 정보를 사전에 파악할 수 있습니다.

일반적인 용리 프로토콜

관심 샘플 성분을 분리하고 불순물을 제거하기 위한 2가지 일반적인 전략이 있습니다.

• 관심 성분이 카트리지를 통과하는 동안 매트릭스 간섭물질 흡착
• 매트릭스 간섭물질이 카트리지를 통과하는 동안 관심 성분 흡착

첫 번째 전략은 일반적으로 원하는 샘플 성분이 고농도로 존재할 때 선택합니다. 관심 성분이 낮은 수준으로 존재하거나 극성이 매우 다른 여러 성분을 분리해야 할 경우에는 일반적으로 두 번째 전략이 사용됩니다. 매우 낮은 수준으로 존재하는 화합물의 미량 농축물과 희박한 샘플의 농도 또한 두 번째 전략을 통해 분리할 수 있습니다.

SPE(고체상 추출법) 절차의 단계

다음 섹션에서는 완전한 고체상 추출법 절차와 관련된 단계를 설명합니다. 많은 응용 분야에서 아래에 나열되고 그 후에 일반적인 예시로 설명되는 단계 중 하나 이상을 생략할 수 있으며, 이를 통해 절차를 간소화할 수 있습니다. 여기에 설명된 절차에서는 분리가 쉽게 가시화될 수 있도록 염료가 포함된 샘플을 사용합니다. 대부분의 샘플에는 수집된 분획에 특정 유형의 검출기 또는 테스트가 필요한 무색의 성분이 포함되어 있다는 점에 유의하십시오. 자체적인 절차를 개발하거나 문서에 게시된 절차를 수정할 때는 다음 정보를 지침으로 사용해 주십시오.

1. 샘플의 전처리
2. 카트리지 컨디셔닝
3. 샘플 로드
4. 분획 용리

순상 크로마토그래피

이 모드는 화학적 성질이 소수성부터 중간 극성까지 다양한 중성 유기 화합물을 분리하는 데 일반적으로 사용됩니다.

SPE 카트리지를 사용하여 순상 크로마토그래피를 수행하려면 극성 충전제와 비극성 용매의 계단식(step) 그래디언트를 사용하십시오.

1. 일반적으로 샘플이 용해된 것과 동일한 용매를 사용해 비극성 용매의 6~10배 되는 머무름 부피로 카트리지를 컨디셔닝합니다.
2. 샘플 용액을 카트리지 베드에 로드합니다.
3. 원치 않는 성분을 비극성 용매로 용리시킵니다.
4. 첫 번째 관심 성분을 더 극성이 강한 용매로 용리시킵니다.
5. 나머지 관심 성분을 더 극성인[더 강한] 용매로 계속해서 용리시킵니다.
6. 모든 성분을 회수하면 사용한 카트리지를 안전하고 적절한 방법으로 폐기하십시오.

이 절차를 보여주기 위해 카트리지 베드에 처음 로드했을 때 검은색으로 보이는 중성, 상대적으로 비극성인 3가지 유기 염료[노란색, 빨간색, 파란색]가 혼합된 샘플이 아래 그림에 나와 있습니다.

SPE 카트리지의 순상 크로마토그래피의 일반적 용리 프로토콜을 보여주는 이미지
(Silica, Florisil, Alumina, Diol, CN, NH₂)

역상 크로마토그래피

환경 용수에서 과일과 야채, 음료에서 생물학적 유체에 이르기까지 광범위한 분야에 걸친 수용성 샘플의 다양성으로 인해 역상 크로마토그래피는 SPE에서 가장 많이 사용되는 모드가 되었습니다.

SPE 카트리지로 역상 크로마토그래피를 수행하려면 비극성 충전제를 사용해 강극성 용매에서 약극성 용매[약한 용매 용리 강도부터 강한 용매 용리 강도까지]로 이어지는 그래디언트를 사용합니다.

1. 실리카 결합상 또는 고분자 충전제를 methanol 또는 acetonitrile의 6~10배 되는 머무름 부피로 용해시킵니다. 카트리지를 물 또는 완충액의 6~10배 되는 머무름 부피로 씻어냅니다. [HLB를 사용하지 않는 한] 카트리지가 마르지 않도록 하십시오.
2. 강한 극성 [약한] 용매[일반적으로 물]에 용해된 샘플을 로드합니다.
3. 원치 않는 성분을 강한 극성의 용매로 용리시킵니다.
4. 머무름성이 약한 관심 성분을 극성이 낮은 용매로 용리시킵니다.
5. 보다 단단하게 결합된 성분을 비극성이 강한[더 강한] 용매로 용리시킵니다.
6. 모든 관심 성분을 회수하면 사용한 카트리지를 안전하고 적절한 방법으로 폐기하십시오.

이 절차를 보여주기 위해 두 개의 극성 식품 염료[빨간색, 파란색] 및 설탕과 인공향을 함유한 수용성 포도 음료[실제 포도 주스가 아님!]의 샘플에 대해 아래 그림에 나와 있습니다. 준비된 이 음료는 염료 농도가 희박하기 때문에 유리잔에서 연한 보라색으로 보입니다. 준비된 SPE 카트리지에 일부분이 로드되면 머무름성이 강한 염료가 진한 보라색 띠로 유입구 부근에 집중됩니다.

SPE 카트리지상에 있는 역상 크로마토그래피의 일반적 용리 프로토콜을 보여주는 이미지
(C₁₈, tC₁₈, C₈, CN, Diol, HLB, Porapak RDX, NH₂)

이온 교환 크로마토그래피

이온 또는 이온화가 가능한 화합물은 이온 교환 크로마토그래피를 통해 가장 잘 분리되는 경우가 많습니다. 이 분리 모드는 보다 널리 사용되는 순상 및 역상 모드와 직교하며 샘플 전처리 프로토콜에 강력하고 선택적인 두 번째 차원을 제공합니다.

음이온과 양이온 교환의 두 가지 주요 단계 유형 및
반대 전하의 분자를 선택적으로 끌어당겨 머무르게 하는 방법에 대한 이미지

SPE 카트리지로 이온 교환 크로마토그래피를 수행하려면 이온 교환 충전제와 함께 그래디언트 pH 또는 이온 세기를 사용합니다.

1. 탈이온수 또는 약한 완충액을 사용해 6~10배 되는 머무름 부피로 카트리지를 컨디셔닝합니다.
2. 탈이온수 또는 완충액에 용해시킨 샘플을 로드합니다.
3. 원치 않는 약하게 결합된 성분은 약한 완충액을 사용하여 용리시킵니다.
4. 첫 번째 관심 성분은 더 강한 완충액(pH 또는 이온 세기 변경)로 용리시킵니다.
5. 계속해서 더 강한 완충액으로 다른 성분을 용리시킵니다.
6. 모든 성분을 회수하면 사용한 카트리지를 적절한 방법으로 폐기하십시오.

이 절차를 보여주기 위해 pK_a 값이 서로 다른 두 이온 염료의 수용성 혼합물의 샘플을 아래 그림에 나타냈습니다. 카트리지에 로드하면 두 성분이 모두 강하게 머무르게 되고 파란색과 노란색 성분의 조합이 유입구 근처에 초록색 띠로 나타납니다.

SPE 카트리지의 이온 교환 크로마토그래피를 위한 일반적 용리 프로토콜을 보여주는 이미지
(NH₂, Accell™ Plus QMA, Accell Plus CM, SCX, SAX, WCX, WAX)

양이온 교환기와 음이온 교환기는 표면에 있는 이온기의 종류에 따라 약한 교환기와 강한 교환기로 분류됩니다. 강한 양이온 교환기는 항상 전체 pH 범위에 걸쳐 이온화[음전하]되는 술폰산과 같은 산성 표면을 가지고 있습니다. 약한 양이온 교환기는 높은 pH에서는 음전하를 띠지만 낮은 pH에서는 중성인 카르복실산과 같은 산성 표면을 가지고 있습니다. 마찬가지로 강한 음이온 교환기는 일반적으로 항상 양전하를 띠는 4차 암모늄기를 가지고 있는 반면, 약한 음이온 교환기는 낮은 pH에서는 양전하를 띠지만 높은 pH에서는 중성인 1차, 2차 또는 3차 아민기를 가지고 있습니다.

다음 표를 참고하여 분석물에 적합한 SPE 교환 카트리지 유형을 선택하십시오.

Mixed-mode 이온 교환 크로마토그래피는 역상 및 이온 교환 모드를 단일 SPE 카트리지상의 단일 프로토콜로 결합해 줍니다. 따라서 중성, 산성, 염기성 화합물을 단일 복합 매트릭스에서 격리 및 분리할 수 있습니다. 이상적인 Mixed-mode SPE Sorbent 기질은 소수성 화합물의 강한 역상 머무름을 나타내면서 습윤성을 유지합니다. 표면에는 위에서 설명한 4가지 일반 유형 중 하나에 해당하는 이온 교환 기능이 있습니다. 중성 화합물을 분리하기 위해 적절한 용리 강도의 유기용매 혼합물[중성 상태의 이온화 가능한 분석물 포함]의 중간 세척제를 사용할 수 있습니다. 이온 결합 분석물의 선택적 용리는 분석물[강한 이온 교환기에 결합되어 있는 경우] 또는 Sorbent[약한 이온 교환기에 결합되어 있는 분석물의 경우]의 전하를 조작하는 방법으로 수행할 수 있습니다.