SPE 입문자 가이드
샘플 전처리 향상을 위한 강력한 도구
분석 과학자는 원하는 결과물을 얻기 위한 최상의 도구를 결정할 때 많은 어려움에 직면하게 됩니다. 샘플 전처리 도구와 접근법에 대한 판단은 성공에 큰 영향을 미칠 수 있는 중요한 결정 사항입니다.
샘플 전처리를 하지 않아도 된다면 더할 나위 없이 좋을 것입니다. 그러나 실제로는 샘플 전처리가 필요한 경우가 많습니다. 처리량을 향상시키거나 분석당 비용을 낮추기 위해 기존 샘플에 대한 분석법을 최적화해야 할 수도 있습니다. 또는 새로운 표적 화합물에 대해 보고하기 위해 다양한 유형의 샘플을 분석해야 할 수도 있습니다. 각각의 새로운 샘플 유형은 서로 다른 분석적 과제를 제시할 수 있습니다. 또한 오늘날 과학자들은 정확도와 정밀도의 절충 없이 그 어느 때보다 낮은 농도 수준에서 값을 보고해야 하는 중대한 과제에 직면해 있습니다.
이 문서는 샘플 전처리 기술에서 매우 강력한 도구인 SPE(고체상 추출법)에 대해 알아보고 그에 대한 이해를 돕기 위해 작성되었습니다. 크로마토그래피 충전제가 포함된 장치를 사용하는 이 기술이 어떻게 분석 문제의 해결에 도움을 주는지 직접 확인해 보십시오.
고체상 추출법의 정의
SPE는 고체 입자, 일반적으로 카트리지 형태의 장치에 포함된 크로마토그래피 충전제를 사용하여 샘플의 여러 성분을 화학적으로 분리하는 샘플 전처리 기술입니다. 샘플은 일반적으로 액체 상태입니다[특수 응용 분야의 경우 일부 샘플은 기체상으로 실행될 수 있음]. 그림 1은 검은색으로 나타나는 샘플을 SPE 장치에서 처리하여 샘플을 구성하는 개별 염료 화합물이 크로마토그래피로 분리되도록 하는 과정을 보여줍니다.
그림 1. SPE 분석법의 예시.
크로마토그래피 베드를 통해 샘플의 여러 화합물을 분리하여 이후의 분석 테스트를 보다 성공적으로 수행할 수 있습니다. 예를 들어 SPE는 간섭물질을 선택적으로 제거하는 데 주로 사용됩니다.
크로마토그래피 입자가 고체이고 샘플은 액체 상태이기 때문에 기술적으로 정확한 이름은 ‘액체-고체상 추출법’입니다. HPLC에서 사용되는 액체 크로마토그래피와 동일한 기본 크로마토그래피 원리가 여기에도 적용되지만, 사용하는 방식과 이유는 다릅니다. 여기서 크로마토그래피는 분석 테스트를 위해 샘플을 제출하기 전에 전처리를 개선하기 위해 사용됩니다.
샘플 전처리의 경우 샘플의 소스는 다양할 수 있습니다. 플라즈마, 침 또는 소변과 같은 생물학적 액체, 물, 공기, 토양과 같은 환경 분야의 샘플, 곡물, 고기, 해산물과 같은 식품, 의약품, 영양제, 음료, 또는 산업 제품일 수도 있습니다. 심지어 모기의 머리 또한 샘플이 될 수 있습니다! 과학자들이 모기의 뇌에서 추출한 신경 펩타이드를 분석해야 할 때 샘플 전처리 방법으로 SPE를 선택하였습니다[Waters Applications Database, 1983].
SPE의 4가지 주요 이점
SPE에는 많은 이점이 있지만 4가지 주요 이점을 특히 주목할 만합니다.
1. 화합물 정제를 통한 복합 샘플 매트릭스의 간소화
분석 화학자에게 가장 어려운 과제 중 하나는 곡물의 마이코톡신, 새우의 잔류 항생물질, 혈장, 혈청 또는 소변 내 약물 대사체와 같은 복합 샘플 매트릭스에 표적 화합물이 포함되어 있는 경우입니다. 샘플 매트릭스에 많은 수의 간섭물질 성분이나 물질이 표적 화합물과 함께 존재하기 때문에 분석은 매우 어려워집니다.
표적 화합물을 식별하고 정량화하기 위해 분리해야 하는 물질이 너무 많기 때문에 해결해야 할 첫 번째 과제는 분석 자체의 복잡성입니다. 그림 2를 참조해 주십시오.
그림 2. 복합 샘플의 예시.
미세한 변경 사항도 중요한 분석물 분리의 분리능에 영향을 미칠 수 있기 때문에 분석에 대한 완건성이 충분하지 않을 수 있습니다.
또 다른 고려 사항은 원래 샘플 매트릭스에 간섭물질이 존재하면 각 주입 시 오염 축적으로 인해 기기 가동 중단이 발생할 수 있다는 것입니다. 간섭물질이 샘플 전처리 과정에서 제거되면, 보다 단순하고 강력한 분석법으로 표적 화합물을 분석할 수 있을 것입니다. 위의 원래 샘플과 아래의 새로운 SPE 전처리 샘플을 비교해 보여주는 그림 3에서 해당 내용을 확인할 수 있습니다.
그림 3. 샘플 매트릭스의 복잡성 비교.
샘플 매트릭스를 단순화할 경우 추가적으로 얻을 수 있는 이점은 정량화의 정확도가 향상된다는 것입니다. 그림 4의 화합물 1에 대한 상단의 파란색 트레이스는 처음에는 허용 가능한 수준으로 보입니다. 그러나 바로 아래에 표시된 빨간색 blank 샘플 매트릭스의 트레이스와 비교해 보면 샘플 매트릭스에 약간의 오염이 있다는 것을 알 수 있습니다. 적절한 SPE 프로토콜을 거친 아래의 트레이스는 간섭물질 문제를 일으키지 않는 동일한 화합물을 보여주므로, 정량화 과정이 보다 정확해질 수 있습니다.
그림 4. 보다 나은 샘플 전처리로 정량화 개선.
그림 5에는 또 다른 예시가 있습니다. 위쪽의 트레이스는 화합물 1과 화합물 2 모두에서 샘플 매트릭스로에 상당한 간섭물질이 있음을 보여줍니다. 아래쪽의 트레이스는 SPE를 사용한 적절한 샘플 전처리를 통해 훨씬 향상된 결과[깔끔한 베이스라인]를 보여줍니다. 베이스라인이 깔끔할수록 분석 결과의 정확도가 향상됩니다. 또한 샘플이 화합물의 분리 및 정제를 필요로 하는 경우 보다 순수한 추출물을 얻을 수 있습니다.
그림 5. SPE 기술을 통한 베이스라인의 상당한 개선.
2. MS 응용 분야에서 이온 억제 또는 이온 강와 감소
복합 샘플 매트릭스의 두 번째 과제는 질량분석기 출력[LC-MS 또는 LC/MS/MS]을 통해 알 수 있습니다. 적절한 MS 시그널 반응[감도]을 위해 화합물 이온이 올바르게 형성되도록 해야 합니다. 샘플 매트릭스의 간섭물질에 의해 화합물 이온의 형성이 억제되는 경우에는 시그널 세기가 크게 저하됩니다.
이 효과는 그림 6에서 확인할 수 있습니다. 위 출력은 생리 식염수에 주입한 표적 화합물의 시그널입니다. 아래의 트레이스는 인간 혈장에서 분석할 경우 동일한 화합물의 반응이 현저하게 감소함[90% 이상 억제]을 보여줍니다. 아래쪽 트레이스의 경우 공통적인 단백질 침전 단계만 수행하였습니다. 이 기술은 이온 억제를 유발하는 매트릭스 간섭물질을 정제하지 않으므로 시그널 반응이 좋지 않습니다.
그림 6. 샘플 매트릭스로 인한 이온 억제 예시
이 억제 효과의 또 다른 좋은 예시는 그림 7에서 확인할 수 있습니다. 단백질 침전 단계만으로 혈장 샘플을 전처리한 MS 출력의 위 트레이스에서는 terfenadine 피크가 80% 억제되는 것을 확인할 수 있습니다. 동일한 샘플을 SPE 분석법으로 전처리한 아래의 트레이스에서는 이온 억제 효과가 줄어든 것을 확인할 수 있습니다. 샘플 매트릭스의 간섭물질이 제거되었기 때문에, 화합물 이온이 적절하게 형성되고, 보다 나은 시그널을 생성할 수 있습니다.
그림 7. 적절한 SPE로 이온 억제 감소.
경우에 따라서는 샘플 매트릭스의 간섭물질로 인해 화합물에 대해 보고된 시그널이 인위적으로 증가할 수 있습니다. 이를 이온 강화라고 하며, 보고값이 부정확하게 높아집니다. 적절한 SPE 분석법은 화합물의 간섭물질을 제거하여 이온 강화 효과를 줄이고 보다 정확한 보고값을 산출할 수 있습니다.
3. 종류별 화합물 분석을 위한 샘플 매트릭스의 분류별 분석
분석자는 이후의 분석이 훨씬 더 효율적으로 수행될 수 있도록 많은 화합물을 포함하는 샘플을 종류별로 분리해야 할 필요가 있습니다. 예를 들어, 청량 음료는 다양한 화합물을 함유하고 있습니다. 여러 종류의 화합물을, 이를테면 극성에 따라 분리하는 SPE 분석법을 개발할 수 있습니다. 극성 화합물은 더 많은 무극성 화합물로부터 분리된 분획물로써 수집될 수 있습니다. 이 두 가지 분획물은 유사성이 높기 때문에 훨씬 더 효율적인 분석법으로 분리되어 분석될 수 있습니다.
SPE에 의한 분획 성능의 예시는 그림 8에서 볼 수 있습니다. 여기서, 건조된 분말[보라색 포도 음료 믹스]의 복합 샘플은 극성 화합물의 분획, 정제된 빨간색 화합물, 정제된 파란색 화합물, 그리고 나머지 모든 무극성 화합물을 포함하는 4가지 분획으로 쉽게 분리됩니다. 이 문서의 다른 섹션에서 이 기능이 얼마나 강력한지 확인할 수 있으실 것입니다.
그림 8. SPE의 샘플 전처리.
SPE의 샘플 분획에 대한 자세한 설명은 분석법 개발 섹션의 125페이지를 참조하십시오.
4. 극저수준 화합물의 극미량 농도[농축]
오늘날에는 ppt[parts per trillion] 농도 수준, 심지어 더 낮은 농도의 화합물에 대해 보고해야 할 필요성이 그 어느 때보다도 커졌습니다. 순수한 샘플에서는 일반적으로 분석 기기의 감도 성능보다 더 낮은 수준을 요구합니다.
이에 대한 예시로 환경 샘플의 극미량 오염물 분석 또는 생물학적 유체에서의 시간 경과에 따른 대사체 개발을 들 수 있습니다. 그림 9의 위쪽 트레이스는 원 순수 샘플에서 표적 화합물에 대한 반응이 좋지 않다는 것을 보여줍니다. 아래쪽 트레이스는 동일한 분석 조건하에 트레이스 농도 전략에 사용된 SPE로 전처리한 샘플을 사용할 경우 이 화합물에 대한 시그널 세기가 극적으로 증가함을 보여줍니다. 이를 통해 순수한 샘플에서 원래 화합물 농도를 정확하게 산출할 수 있습니다.
그림 9. 극미량 농도 예시.
SPE 크로마토그래피 충전제의 머무름 능력 없이 다른 샘플 전처리 접근법을 사용한다면 특정 화합물을 극미량 농도로 농축하는 것은 불가능하지는 않더라도 매우 어려울 것입니다.
요약
지금까지 살펴본 바와 같이, 크로마토그래피 베드가 있는 SPE 장치는 보다 성공적인 샘플 분석을 위해 4가지 중요한 기능을 수행할 수 있습니다. 그림 10를 참조해 주십시오.
그림 10. SPE의 성능.
이 문서를 통해 우리는 SPE의 기초와 지난 30년 동안 이 기술을 활용해 온 전세계의 과학자들로부터 찾아낸 성공 기술을 소개하고자 했습니다. 오늘날, 과학자들은 어려운 샘플 전처리와 분석 문제를 해결하는 데 SPE가 그 어느 때보다 유용하게 활용될 수 있다는 것을 인식하고 있습니다.
이 문서를 통해 SPE의 성능을 이해하고 마스터함으로써 이 기술의 힘을 여러분의 실험실에서 활용할 수 있기를 바랍니다.
