액체 크로마토그래피 입문자 가이드

일반적으로 화합물의 세 가지 주요 특성을 이용하여 HPLC 분리를 생성할 수 있습니다. 다음과 같은 특성이 있습니다.

• 극성
• 전기 전하
• 분자 크기

먼저 극성과 이 특성을 이용하는 두 가지 주요 분리 모드인 순상 및 역상 크로마토그래피에 대해 살펴보겠습니다.

극성에 따른 분리

분자의 구조, 활성도 및 물리화학적 특성은 구성 원자의 배열과 이들 간의 결합에 의해 결정됩니다. 분자 내에서 특수한 특성과 예측 가능한 화학 반응의 배경이 되는 특정 원자의 특정한 배열을 작용기라고 합니다. 이 구조에 따라 분자가 극성인지 아니면 비극성인지가 결정됩니다. 유기 분자는 각각이 포함하는 주요 작용기에 따라 여러 부류로 분류됩니다. 극성에 따른 분리 모드를 사용할 때, 서로 다른 종류의 분자에 대한 상대적 크로마토그래피 머무름은 이러한 작용기의 특성 및 위치에 따라 크게 달라집니다. 그림 P에서 볼 수 있듯이 분자의 부류는 해당하는 머무름 시간에 따라 높은 극성에서 높은 비극성까지 크로마토그래피 극성의 범위 또는 스펙트럼으로 정렬할 수 있습니다.

물[쌍극자 모멘트가 높은 저분자]은 극성 화합물입니다. 벤젠[방향족 탄화수소]은 비극성 화합물입니다. 크로마토그래피 극성이 유사한 분자는 서로 끌어당기는 경향이 있습니다. 반대로, 극성이 다른 분자는 훨씬 더 약한 인력을 가지고, 심지어 서로 반발할 수도 있습니다. 이러한 특성은 극성에 따른 크로마토그래피 분리 모드의 기반이 됩니다.

우리가 잘 알고 있는 또 다른 방법으로 이것을 설명하자면 오일[무극성]과 물[극성]은 섞이지 않는다는 것입니다. 반대 극이 서로를 끌어당기는 자석과 달리, 극성에 따른 크로마토그래피 분리는 같은 것끼리는 강하게 끌어당기고 다른 것끼리는 약하게 끌어당긴다는 원리를 따릅니다. 극성 기반 크로마토그래피에서는 “유유상종”의 원리가 작용한다는 것을 기억하십시오.

크로마토그래피 분리 시스템을 설계하기 위해[그림 Q 참조] 우리는 극성이 다른 이동상과 고정상을 선택하여 샘플에 포함된 다양한 화합물에 대해 경합 조건을 만듭니다. 그러면 정지상[컬럼 충전재]과 극성이 유사한 샘플의 화합물이 입자에 더 강하게 끌리므로 이동이 지연됩니다. 이동상의 극성과 유사한 극성을 가진 화합물은 이동상에 끌리게 되므로 더 빠르게 움직입니다.

이러한 식으로 각 상에 대한 각 화합물의 상대적 끌림의 차이를 바탕으로 분석물의 속도를 달리하여 분리를 이뤄냅니다.

그림 R-1, R-2, R-3은 각각 이동상, 고정상 및 샘플 분석물의 일반적인 크로마토그래피 극성 범위를 나타냅니다. 극성 기반 HPLC 분리를 만들어내는 데 필요한 끌림의 경합 조건을 생성하기 위해 크로마토그래피 전문가가 적절한 상을 선택하는 방법을 차례로 살펴보겠습니다.

그림 R-1에 표시된 것과 같이 몇 가지 일반적인 용매를 상대적인 크로마토그래피 극성의 순서로 나열한 스케일을 용리 서열(eluotropic series)이라고 합니다. 끌림이 강한 고정상 위치를 놓고 분석물 분자와 실질적으로 경합하는 이동상 분자는 이러한 분석물을 대체하여 컬럼을 통해 더 빠르게 이동하도록 합니다[약하게 유지됨]. 물이 이동상 용매 스케일의 극성 말단에 있고 지방족 탄화수소인 헥산이 비극성 말단에 있습니다. 그 사이에 단일 용매와 혼화성-용매 혼합물[특정한 분리 요구를 충족하도록 적절한 비율로 혼합]을 용리 강도 순서로 배치할 수 있습니다. 스케일의 어느 쪽 끝이 ‘가장 강한’ 이동상을 나타내는지는 분석물 분자에 대한 경합이 일어나는 고정상 표면의 특성에 따라 달라집니다.

실리카는 산성 실라놀[실리콘 함유 알코올 유사체] 작용기를 포함하는 활성 친수성[물을 좋아하는] 표면을 가지고 있습니다. 이 물질은 그림 R-2의 정지상 스케일에서 극성 말단에 속합니다. 실리카 표면의 활성도 또는 극성은 여기에 극성이 약한 작용기[결합상]를 화학적으로 결합시켜 변형시킬 수 있습니다. 여기에 표시된 예는 극성이 감소하는 순서로 실리카의 cyanopropylsilyl-[CN], n-octylsilyl-[C₈] 및 n-octadecylsilyl-[C₁₈, ODS] 부분을 포함합니다. 후자는 소수성[물을 싫어함]의 비극성이 강한 충전재입니다.

그림 R-3은 샘플의 크로마토그래피 극성 스펙트럼을 다시 한 번 보여줍니다[그림 P 참조]. 크로마토그래피 전문가는 두 상의 극성을 고려한 후, 주어진 고정상에 대해 관심 분석물이 유지되지만, 용리될 수 없을 정도로 강력하지는 않은 이동상을 선택해야 합니다. 그리고 비슷한 강도의 용매 중에서 크로마토그래피 시스템의 선택성를 최대화하기 위해 분석물 극성과 용해도의 미세한 차이를 가장 잘 활용할 수 있는 상의 조합을 고려합니다. 유유상종의 원칙이 있기는 하지만 지금까지의 논의를 바탕으로 예상할 수 있듯이 극성에 따라 분리를 생성하려면 샘플에 대한 지식과 다양한 분석물 유형 및 머무름 모드에 대한 경험이 필요합니다. 요약하면, 크로마토그래피 전문가는 극성이 반대인 이동상과 입자 고정상으로 최상의 조합을 선택해야 합니다. 그러면 샘플 분석물이 컬럼을 통과할 때 유유상종의 규칙에 따라 어떤 분석물의 속도가 느려지고 빨라지는지 결정됩니다.

순상 HPLC

식물 추출물을 분리하는 과정에서 Tswett은 극성 고정상[유리 컬럼의 백악 재료; 그림 A 참조]을 극성이 훨씬 적은[무극성] 이동상과 함께 사용하여 성공적인 결과를 얻었습니다. 이 고전적인 크로마토그래피 모드는 순상(normal-phase)으로 알려지게 되었습니다.

그림 S-1은 3가지 염료 테스트 혼합물의 순상 크로마토그래피 분리를 보여줍니다. 고정상은 극성이어서 극성인 노란색 염료를 가장 강하게 유지시킵니다. 상대적으로 비극성인 파란색 염료는 비극성 용매인 이동상과의 머무름 경합에서 밀려 빠르게 용리됩니다. 파란색 염료는 이동상[둘 다 비극성]과 가장 비슷하기 때문에 더 빠르게 이동합니다. 이동상이 100% 유기물(물 전혀 포함 안 함)인 것은 실리카의 순상 크로마토그래피에서 일반적입니다.

역상 HPLC

역상은 순상, 즉 극성 이동상과 비극성[소수성] 고정상을 사용하는 크로마토그래피와 반대되는 모드를 나타냅니다. 그림 S-2는 이러한 프로토콜을 사용하여 분리되는 검정색의 3가지 염료 혼합물을 보여줍니다.

여기서 가장 강하게 유지되는 화합물은 비극성이 강해서 비극성 고정상에 가장 강하게 끌리는 파란색 염료입니다. 약하게 유지되는 극성 노란색 염료는 극성인 수성 이동상에 의해 경합에서 밀리고 베드를 통과해 가장 빠르게 이동하므로 (유유상종의 원칙에 따라) 가장 먼저 용리됩니다.

오늘날 역상 크로마토그래피는 재현성 및 적용 범위가 넓어지면서 전체 HPLC 분석법의 약 75%를 차지할 만큼 많이 이용됩니다. 이러한 프로토콜의 대부분은 아세토니트릴 또는 메탄올과 같은 혼화성 극성 유기 용매와 물의 수성 혼합물을 이동상으로 사용합니다. 그러면 일반적으로 비극성 소수성 입자 표면과 분석물의 적절한 상호 작용이 보장됩니다. C₁₈ 결합 실리카[ODS라고도 함]는 가장 널리 사용되는 역상 HPLC 충전재 유형입니다.

표 C는 두 가지 주요 HPLC 분리 모드에 대한 상 특성을 극성에 따라 요약한 것입니다. 이러한 극성 기반 모드의 경우 유유상종의 원칙을 기억하십시오.

친수성 상호작용 크로마토그래피[HILIC]

HILIC는 순상 크로마토그래피의 변형으로 볼 수 있습니다. 순상 크로마토그래피에서 이동상은 100% 유기물입니다. 이동상과 극성 충전재 입자의 공극에는 미량의 물만 존재합니다. 극성 분석물은 극성 고정상에 강하게 결합하여 용리되지 않을 수 있습니다.

유기 이동상[일반적으로 아세토니트릴과 같은 비양성자성 용매]에 약간의 물[<20%]을 첨가하면 순상 모드에서 강하게 유지되는[또는 역상 모드에서 약하게 유지되는] 극성 화합물을 분리하고 용리시킬 수 있습니다. 극성이 매우 강한 용매인 물은 고정상 자리를 놓고 극성 분석물과 실질적으로 경합합니다. HILIC는 등용매(Isocratic) 또는 그래디언트 용리 모드에서 실행할 수 있습니다. 처음에 극성 충전재 입자에 끌린 극성 화합물은 이동상의 극성[강도]이 증가함에 따라[물을 더 첨가한 결과] 용리될 수 있습니다. 분석물은 친수성[물에 상대적인 크로마토그래피 극성]이 증가하는 순서로 용리됩니다. 이온화 가능한 분석물을 단일 형태로 유지하기 위해 완충액 또는 염을 이동상에 첨가할 수 있습니다.

소수성 상호작용 크로마토그래피[HIC]

HIC는 단백질과 같은 큰 생체 분자를 분리하는 데 사용되는 일종의 역상 크로마토그래피입니다. 이러한 분자를 변성시킬 수 있는 유기 용매 또는 표면과의 접촉을 피하기 위해 수용액에서 손상되지 않은 상태로 유지하는 것이 바람직합니다. HIC는 옥타데실 결합[C₁₈] 실리카가 아닌 부틸 결합[C₄]과 같이 중간 정도의 소수성을 가진 고정상과 큰 분자의 소수성 상호 작용을 활용합니다. 처음에는 물의 염 농도를 높여 단백질이 충전재에 머무르게 합니다[염석]. 그래디언트 분리는 일반적으로 염 농도를 감소시키는 방법으로 실행됩니다. 이와 같이 소수성(hydrophobicity)이 증가하는 순서로 생체 분자가 용리됩니다.

전하에 따른 분리: 이온 교환 크로마토그래피[IEC]

극성에 따른 분리의 경우, 같은 것은 같은 것에 끌리고 반대되는 것은 배척할 수 있습니다. 전하를 기반으로 하는 이온 교환 크로마토그래피와 기타 분리 방식에서는 이 규칙이 반대입니다. 같은 것은 반발하고 반대되는 것은 서로 끌어당깁니다. 이온 교환 분리를 위한 고정상은 표면의 산성 또는 염기성 작용 특성과 강도, 그리고 끌어당기고 유지하는 이온 유형에 따라 그 특징이 결정됩니다. 양이온 교환은 음의 표면에서 양전하를 띤 이온을 유지하고 분리하는 데 사용됩니다. 반대로, 음이온 교환은 양의 표면에 음전하를 띤 이온을 유지하고 분리하는 데 사용됩니다[그림 T 참조]. 각 유형의 이온 교환에는 분리 및 용리에 대한 두 가지 일반적인 접근 방식이 있습니다.

강한 이온 교환체는 항상 이온화되는 작용기[예: 4차 아민 또는 설폰산)를 포함합니다. 이들은 일반적으로 약한 이온을 유지하고 분리하는 데 사용됩니다. 이러한 약한 이온은 고정상 사이트에 더 강하게 끌리는 이온을 포함하는 이동상으로 대체됨으로써 용리될 수 있습니다. 또는 약한 이온이 컬럼에 남아 있다가 제자리에서 이동상의 pH를 변화시켜 중성화됨으로써 인력을 잃고 용리될 수 있습니다.

약한 이온 교환체[예: 2차 아민 또는 카르복실산 작용기]는 특정 pH 값 이상 또는 이하에서 중성화되고, 전하에 의해 이온을 유지하는 능력을 잃을 수 있습니다. 하전되었을 때는 강한 이온을 유지하고 분리하는 데 사용됩니다. 대체를 통해 이러한 이온을 용리시킬 수 없는 경우 고정상 교환 위치가 중성화되어 이온 인력을 차단하고 하전된 분석물이 용리되도록 할 수 있습니다.

약이온 교환체가 중성화되면 소수성[역상] 또는 친수성[순상] 상호작용에 의해 화학종을 유지하고 분리할 수 있습니다. 이러한 경우 용리 강도는 이동상의 극성에 따라 결정됩니다[그림 R-1]. 따라서 약이온 교환체는 혼합 모드 분리[극성과 전하를 기반으로 한 분리]에 사용할 수 있습니다.

표 D에는 이온 교환의 주요 범주에 대한 가이드라인이 나와 있습니다. 예를 들어, 강염기성 분석물[항상 양전하를 띰]을 유지하려면 pH > 7에서 약한 양이온 교환 고정상 입자를 사용합니다. 그러면 입자 표면이 음으로 대전되게 할 수 있습니다. 강염기를 방출하거나 용리하려면 이동상의 pH를 3 미만으로 낮춰야 합니다. 그러면 표면 전하가 제거되고 이온 교환 머무름 메커니즘이 차단됩니다.

pK_a는 작용기의 50%가 이온화되고 50%가 중성인 pH 값입니다. 본질적으로 분석물 또는 입자 표면을 중성이나 완전히 하전된 상태로 보장하려면 pK_a를 최소 2 단위 초과하는 값으로 pH를 조정해야 합니다[표 D 참고].

강한 염기를 유지하기 위해 강한 양이온 교환체를 사용해서는 안 됩니다. 둘 다 전하를 띠게 되면 서로 강하게 끌어당기므로 염기를 용리하는 것이 거의 불가능해집니다. 활성 교환 위치에 대한 경합에서 이기고 관심 화합물을 훨씬 더 강력하게 유지하고 대체할 수 있는 경쟁 염기로 강력한 양이온 교환체를 압도해야 제거할 수 있습니다. HPLC 및 SPE에서는 이 방식이 대체로 실용적이지 않거나 안전하지 않습니다. [매우 강한 산과 염기는 작업하기에 위험하며 HPLC 유체에 사용되는 구성 재료를 부식시킬 수 있습니다!]

크기에 따른 분리: 크기 배제 크로마토그래피[SEC] – 겔 투과 크로마토그래피[GPC]

1950년대에 Porath와 Flodin은 생체 분자의 분리 메커니즘이 전하나 극성이 아닌 크기에 기반하며, 따라서 제어된 다공성의 친수성 덱스트란 중합체를 통과시키거나 여과시키는 방법으로 분리할 수 있다는 사실을 발견했습니다. 이 과정을 겔 여과라고 합니다. 이후, 합성 올리고머와 고분자를 분리하기 위해 특정한 공극 크기 범위를 가진 유기 고분자 충전재를 사용하는 유사한 방식이 사용되었습니다. 이 과정을 겔 투과 크로마토그래피[GPC]라고 합니다. 제어된 다공성 실리카 고분자를 사용하여 수행되는 유사한 분리 방법을 크기 배제 크로마토그래피[SEC]라고 합니다. 1963년에 도입된 최초의 상용 HPLC 기기는 GPC 응용 분야에 사용하도록 설계되었습니다[참고 문헌 3 참조].

이러한 모든 기술은 일반적으로 관심 분석물이 충전재의 공극 부피 정도로 들어가거나 배제될 수 있는 범위에서 공극 크기 분포를 갖도록 합성된 고정상에서 수행됩니다. 분자가 작을수록 베드를 통과할 때 더 많은 공극에 침투합니다. 분자가 커지면 특정 크기 이상의 공극에만 침투할 수 있으므로 베드에서 보내는 시간이 줄어듭니다. 매우 큰 분자는 공극에서 완전히 배제되고 입자 사이로만 통과하므로 소량으로 매우 빠르게 용리됩니다. 이동상은 두 가지 이유로 선택됩니다. 첫째, 분석물에 좋은 용매입니다. 둘째, 분석물과 고정상 표면 사이의 상호작용[극성 또는 전하에 기초한]을 방지할 수 있습니다. 이런 식으로 큰 분자가 먼저 용리되고 작은 분자는 느리게 이동하여[들어가고 나가면서 더 많은 공극을 이동하기 때문] 용액에서 분자 크기가 작을수록 더 늦게 용리됩니다. 따라서 규칙은 간단합니다: 큰 분자가 먼저 용리됩니다.

고분자의 분자량과 용액에서의 크기를 연관짓는 것이 가능해졌기 때문에 GPC는 고분자의 분자량 분포 측정에 혁명을 일으켰고, 이는 다시 고분자 가공, 품질 및 성능을 향상시키거나 저하시킬 수 있는 물리적 특성을 결정[원하는 특성과 원치않는 특성을 구별하는 방법]할 수 있는 기회를 만들어 주었습니다.

결론

HPLC에 대한 간략한 소개가 도움이 되었기를 바랍니다. 참고문헌을 읽고 HPLC 용어에 대한 부록을 읽어보기를 추천합니다.