액체 크로마토그래피 입문자 가이드

알루미나

순상 흡착 크로마토그래피에서 고정상으로 사용되는 다공성 미립자 형태의 산화알루미늄[Al₂0₃]입니다. 알루미나는 활성이 높은 염기성 표면을 가지고 있습니다(10% 수성 슬러리의 pH는 약 10). 강산으로 연속 세척하여 중성 및 산성 등급[각각 슬러리 pH 7.5 및 4]으로만듭니다. 알루미나는 실리카보다 흡습성이 높습니다. 활성도는 수분 함량에 대한 Brockmann† 척도로 측정됩니다. 예를 들어, 활성도 등급 I에는 1% H₂O가 포함됩니다.

†H. Brockmann 및 H. Schodder, Ber. 74: 73 (1941).

베이스라인*

크로마토그램에서 컬럼에서 이동상만 나타날 때의 검출기 반응을 기록하는 부분입니다.

카트리지

말단 피팅이 없는 컬럼 유형으로, 한쪽 끝의 프릿으로 충전재가 유지되는 단순한 개방형 튜브입니다. SPE 카트리지는 진공 매니폴드에서 병렬로 작동할 수 있습니다. HPLC 카트리지는 끝단에 유체 연결부가 있는 카트리지 홀더에 보관됩니다. 카트리지 컬럼은 말단 피팅이 통합된 기존 컬럼보다 교체가 쉽고 저렴하며 더 편리합니다.

크로마토그램*

검출기 반응 또는 용리액 부피 또는 시간에 대한 용리액의 분석물 농도에 대한 척도로 사용되는 기타 측정량에 대한 그래픽 또는 기타 표현입니다. 평면 크로마토그래피[예: 박막 크로마토그래피 또는 종이 크로마토그래피]에서 크로마토그램은 분리된 영역을 포함하는 종이 또는 층을 나타낼 수 있습니다.

크로마토그래피*

분리할 성분이 두 개의 상 사이에 분포하는 동적 물리화학적 분리 방법으로, 두 상 중 하나는 고정된 상[고정상]이고, 다른 하나[이동상]는 고정상에 대해 상대적으로 이동합니다.

컬럼 부피*[Vc]

충전재를 포함하는 튜브 부분의 기하학적 부피입니다[튜브의 내부 단면적에 충전층 길이 L을 곱한 값]. 간극 부피라고도 하는 컬럼의 입자 간 부피는 충전층의 입자 사이에서 이동상이 차지하는 부피입니다. 보이드 볼륨(void volume)[V₀]은 이동상에 의해 점유된 총 부피, 즉 간극 부피와 입자 내 부피[공극 부피라고도 함]를 합한 부피입니다.

검출기*[감도 참조]

물리적 또는 화학적 특성[예: UV/가시광선 흡광도, 차등 굴절률, 형광 또는 전도도]을 측정하여 용리액 조성의 변화를 나타내는 장치입니다. 검출기의 반응이 샘플 농도에 대해 선형적이면 표준물질을 사용한 적절한 검량을 통해 성분의 양을 정량화할 수 있습니다. 두 가지 유형의 검출기를 직렬로 연결해 사용하면 더 효과적인 경우가 많습니다. 이렇게 하면 샘플 분석물에 대해 보다 확증적이거나 구체적인 정보를 얻을 수 있습니다. 일부 검출기[예: 전기화학, 질량분석 검출기]는 파괴적이기 때문에 샘플 성분의 화학적 변화에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 검출기 유형은 비파괴적 검출기와 함께 구성될 때 일반적으로 유동 경로에서 두 번째에 배치됩니다.

디스플레이

컴퓨터 화면에 검출기의 전기적 반응을 크로마토그램의 형태로 기록하는 장치입니다. 또한 고급 데이터 기록 시스템은 정교한 알고리즘을 사용하여 계산을 수행합니다(예: 피크 면적 적분, 베이스라인 빼기, 스펙트럼 매칭, 성분 정량화, 표준 라이브러리와의 비교를 통한 미지 물질 식별).

효율성[H, 플레이트 수, 분리능, 감도, 속도 참조]

충전층을 통과할 때 샘플 띠가 분산되지 않도록 하는 컬럼의 성능을 나타내는 척도입니다. 효율적인 컬럼은 띠 분산 또는 띠 넓어짐을 최소화합니다. 효과적인 분리, 우수한 감도를 지원해야 하며, 복잡한 샘플 혼합물에서 유사 성분을 식별하기 위해서는 컬럼 효율이 높아야 합니다.

노벨상을 수상한 Martin과 Synge는 증류의 원리를 적용해 크로마토그래피 컬럼 효율의 척도이자 컬럼 성능을 비교하는 수단으로 플레이트 높이[H, 또는 H.E.T.P., 이론적 플레이트에 대한 높이 등가]의 개념을 도입했습니다.† Presaging HPLC 및 UPLC 기술을 통해 이들은 가능한 가장 작은 입자 크기[더 높은 압력이 필요함]로 채워진 균질한 베드가 효율을 최대화하는 열쇠라는 것을 알게 되었습니다. 띠 넓어짐에 영향을 미치는 컬럼과 분리 시스템 파라미터 간의 관계는 나중에 Van Deemter의 방정식으로 설명되었습니다.††

크로마토그래피 전문가들은 크로마토그램의 측정값에서 쉽고 직접적으로 계산할 수 있는 품질, 즉 플레이트 수[N]를 컬럼 효율로 여기는 경우가 많습니다. 플레이트 높이는 N에 대한 컬럼 베드 길이의 비율로 결정됩니다[H = L/N; 크로마토그램에서 N을 계산하는 방법은 그림 U에 나와 있음]. 이러한 방법을 통한 N 또는 H의 계산은 등용매 조건에서만 정확하며 그래디언트 분리에는 사용할 수 없다는 점에 유의하십시오.

†A.J.P. Martin and R.M. Synge, Biochem. J. 35: 1358–1368 [1941]
††J.J. van Deemter, F. J. Zuiderweg and A. Klinkenberg, Chem. Eng. Sci. 5: 271–289 [1956]

용리액

용액에 분석물이 포함되어 컬럼 Outlet에서 나오는 용리액 부분입니다. 분석용 HPLC에서는 검출기로 용리액에 들어 있는 분석물의 농도 또는 질량을 검사합니다. 분취용 HPLC에서는 일정한 시간 또는 부피 간격으로 연속적으로 분취량에서 용리액을 채취하거나, 검출기에서 관심 피크가 나타났다는 징후를 감지할 때만 불연속적으로 수집합니다. 이러한 분획 분취물의 처리를 거쳐 정제된 화합물이 얻어집니다.

용리액

이동상[용리 크로마토그래피 참조].

용리 서열

표준 sorbent의 지정된 분석 물질을 참조하여 용리 강도에 따라 정렬한 용매 목록입니다. 이러한 목록은 등용매 및 그래디언트 용리 방법을 개발할 때 유용합니다. Trappe는 극성이 증가하는 일련의 용매가 알루미나에서 지질 분획을 분리할 수 있음을 보여준 후 이 용어를 도입했습니다.† 나중에 Snyder는 여러 순상 LC sorbent에서 많은 용매에 대한 용매 강도 파라미터를 측정하여 표로 작성했습니다.†† Neher는 순상 용매의 동등 용리[일정한 용리 강도] 혼합물을 선택하여 TLC 분리의 선택성를 최적화할 수 있도록 매우 유용한 노모그램을 만들었습니다.†††

일반적인 순상 용리 서열은 비극성 지방족 탄화수소(예: 펜탄 또는 헥산)의 약한 말단에서 시작하여 벤젠[방향족 탄화수소], 디클로로메탄[염소화 탄화수소], 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트[에스테르], 아세톤[케톤], 마지막으로 메탄올[알코올]의 강한 말단의 순서로 나열됩니다[그림 R-1 참조].

†W. Trappe, Biochem. Z. 305: 150 [1940]
††L. R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker [1968], pp. 192–197
†††R. Neher in G.B. Marini-Bettòlo, ed., Thin-Layer Chromatography, Elsevier [1964] pp. 75–86.

용리*[동사]

용리 크로마토그래피에 의한 크로마토그래피. 용리 과정은 모든 샘플 성분이 크로마토그래피 베드에 있는 동안 중단되거나[평면 박막 또는 종이 크로마토그래피] 성분이 크로마토그래피 베드를 떠날 때까지 계속될 수 있습니다[컬럼 크로마토그래피].

참고: 분리 시스템[이동상과 고정상의 조합]이 특정 분리에 최적화되는 분석법 개발 관행과의 혼동을 피하기 위해 개발(develop)[평면 크로마토그래피에 사용되는 용어]이라는 용어보다 용리(elute)라는 용어가 선호됩니다.

용리 크로마토그래피*

크로마토그래피 분리에서 이동상이 크로마토그래피 베드를 지속적으로 통과하는 절차입니다. HPLC에서 검출기 베이스라인이 안정화되고 분리 시스템이 평형에 도달하면 특정한 양의 샘플 슬러그가 유동 이동상 흐름에 유입됩니다. 모든 관심 분석 물질이 검출기를 통과할 때까지 용리가 계속됩니다.

용리 강도

용매의 친화도를 측정한 값으로 고정상에 대한 분석 물질의 친화도에 상대적인 값입니다. 약한 용매는 분석물을 대체할 수 없으므로 고정상에서 강하게 머무르게 됩니다. 강한 용매는 모든 분석물 분자를 완전히 대체해 이들 분자를 머무르지 않은 상태로 컬럼에서 운반할 수 있습니다. 효과적인 분리와 합리적인 용리 볼륨 사이에 적절한 균형을 유지하기 위해, 용매를 혼합하여 상 사이에 적절한 경합 조건을 유지함으로써 주어진 분석물 세트에 대한 선택성와 분리 시간을 모두 최적화할 수 있습니다[선택성 참조].

쌍극자 모멘트, 유전 상수, 수소 결합, 분자 크기 및 모양, 표면 장력 등이 용리 강도를 나타내는 지표가 될 수 있습니다. 용리 강도는 분리 모드에 의해서도 결정됩니다. 용매의 용리 서열은 흡착 또는 순상 조건에서 한 방향으로 강도를 증가시키는 방법으로 정렬할 수 있습니다. 역상(Reversed-Phase) 분할 조건에서는 그 순서가 거의 반대일 수 있습니다[그림 R-1 참조].

형광 검출기

형광 검출기는 특정 파장의 빛으로 샘플을 들뜬 상태로 만듭니다. 이로 인해 특정 화합물은 형광을 발하고 더 높은 파장에서 빛을 방출합니다. 특정 방출 파장으로 설정되어 들뜬 상태의 소스에 의해 가려지지 않도록 마스킹된 센서는 방출된 빛만 수집합니다. 많은 경우 고유한 형광을 나타내지 않는 분석물은 이러한 검출 형태가 제공하는 높은 감도와 선택성을 활용하기 위해 유도체화할 수 있습니다(예: 아미노산의 AccQ•Tag 유도체화).

유속*

단위 시간에 컬럼을 통과하는 이동상의 부피입니다. HPLC 시스템에서 유속은 용매 전달 시스템[펌프]의 컨트롤러에 의해 설정됩니다. 유속 정확도는 컬럼 Outlet에서 용리액을 시간에 따라 수집하고 측정하는 방법으로 확인할 수 있습니다. 용매의 밀도는 온도에 따라 변하기 때문에 모든 검량 또는 유속 측정에서 이 변수를 고려해야 합니다. 가능한 경우 부피가 아닌 중량으로 측정했을 때가 가장 정확합니다.

유속의 균일성[정밀도] 및 재현성은 많은 LC 기술, 특히 머무름 시간이 분석물 식별의 핵심인 분리에서, 또는 머무름 시간의 검량과 상관 관계가 고분자의 정확한 분자량 분포 측정에 중요한 겔 투과 크로마토그래피에서 중요합니다.

종종 분리 조건은 유속이 아닌 선형 속도를 이용해 비교됩니다. 선형 속도는 유속을 컬럼의 단면적으로 나누어 계산합니다. 유속은 부피/시간[예: mL/min]으로 표현되지만 선형 속도는 길이/시간[예: mm/sec]으로 측정됩니다.

겔-투과 크로마토그래피*

주로 분자 크기 및/또는 모양의 차이에 따른 배제 효과를 기반으로 한 분리입니다. 겔 투과 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피는 고정상이 팽창된 겔 형태일 때의 과정을 설명합니다. 둘 다 크기 배제 크로마토그래피의 한 형태입니다. Porath와 Flodin은 생체 분자의 크기 기반 분리를 위해 덱스트란 겔과 수성 이동상을 사용한 겔 여과를 처음으로 설명했습니다.† Moore는 다공성 폴리스티렌-디비닐벤젠 고분자 겔에서 유기 용매 이동상을 사용하여 용액에서 크기별로 유기 고분자를 분리하는 데 유사한 원리를 적용했습니다.††

†J. Porath, P. Flodin, Nature 183: 1657–1659 [1959]
††J.C. Moore, U.S. Patent 3,326,875 [filed Jan. 1963; issued June 1967]

그래디언트

용리 강도가 증가하는 이동상을 형성하는 두 가지[또는 그 이상] 혼화성 용매 성분의 상대적 농도가 시간 경과에 따라 변화하는 것을 말합니다. 계단식(step) 그래디언트는 일반적으로 고체상 추출에 사용됩니다. 각 스텝에서 용리액 조성은 약한 이동상에서 강한 이동상으로 갑작스럽게 바뀝니다. 각 단계 사이에 SPE sorbent 베드를 건조시켜 한 용매에서 다른 비혼화성 용매로 변경하는 것도 가능합니다.

연속 그래디언트는 일반적으로 일정 기간 동안 초기 용매 A에서 더 강한 용매 B의 농도를 나타내는 미리 결정된 곡선[선형 또는 비선형]에 따라 저압 또는 고압 혼합 시스템[그림 J-2 및 J-3 참조]에 의해 생성됩니다. 고정된 등용매 용매 조성의 유지는 연속 그래디언트 내에서 어떤 시점에서든 프로그래밍할 수 있습니다. 분리가 끝나면 컬럼을 다시 평형 상태로 만들어 다음 샘플 주입을 준비하기 위해 초기 이동상 구성으로 돌아가도록 그래디언트 프로그램을 설정할 수도 있습니다. 정교한 HPLC 시스템은 네 가지 이상의 용매[또는 용매 혼합물]를 연속 그래디언트로 혼합할 수 있습니다.

주입기[Autosampler, Sample Manager]

미리 정해진 양의 샘플 용액을 유동 이동상 흐름에 정확하고 정밀하게 도입[주입]하기 위한 메커니즘입니다. 주입기는 간단한 수동 장치이거나, 미리 결정된 순서로 개별 바이알 또는 웰 어레이에서 많은 샘플을 무인으로 주입하도록 프로그래밍할 수 있는 정교한 자동 샘플 주입기입니다. 이러한 시스템의 샘플 격실은 여러 시간 동안 샘플 완전성을 유지하기 위해 온도를 제어할 수도 있습니다.

대부분의 최신 주입기는 다중 포트 밸브를 통해 온/오프라인으로 전환할 수 있는 일정 형태의 실린지 충전 샘플 루프를 가지고 있습니다. 내부 부피를 최소화하여 잘 설계된 주입 시스템은 가능한 한 컬럼 주입구에 가깝게 배치되어 샘플 띠의 퍼짐을 최소화합니다. 샘플 주입 사이에 이동상 또는 세척 용매로 폐기물을 플러싱하면 캐리오버(carryover)[이전 샘플에 의해 현재 샘플이 오염되는 현상]를 방지할 수 있습니다.

샘플은 가능한 경우 주입될 이동상에 용해시켜 주입을 준비하는 것이 가장 바람직합니다. 이렇게 하면 분리 및/또는 검출 문제를 방지할 수 있습니다. 또 다른 용매를 사용해야 하는 경우에는 해당 용매의 용리 강도가 이동상의 용리 강도 이하인 것이 바람직합니다. 성공적인 분리를 저해할 수 있는 침전 또는 혼화성 문제를 테스트하기 위해 오프라인에서 이동상과 약간의 샘플 용액을 혼합해 보는 것도 좋은 생각일 수 있습니다.

주입구

이동상 흐름과 샘플이 들어가는 컬럼 베드의 끝부분입니다. 다공성의 불활성 프릿이 충전재를 유지하고 입자 오염으로부터 sorbent 베드 주입구를 보호합니다. HPLC 모범 사례에 따르면 샘플과 이동상에는 미립자가 없어야 합니다. 주입구가 훨씬 더 막히기 쉬운 작은 입자 컬럼에는 이 조건이 필수적입니다. 컬럼 베드 주입구가 막히고 정상보다 높은 역압을 나타내는 경우, 때로 유출물이 폐기 방향으로 향하면서 흐름 방향이 반대로 바뀌면 프릿 위에 있던 샘플 잔해물이 떨어져 나와 플러싱되기도 합니다. 잔해물이 프릿을 관통하여 베드 주입구 끝에 박히면 컬럼의 수명이 다할 가능성이 큽니다.

이온 교환 크로마토그래피*[전하에 따른 분리 섹션 참조]

이 분리 모드는 주로 샘플 성분의 이온 교환 친화도 차이를 기반으로 합니다. 작은 입자의 표면 다공성 고효율 이온 교환 컬럼에서 물 또는 완충된 수성 이동상에 포함된 주요 무기 이온 화학 성분을 분리한 후 전도도 또는 전기화학적 검출을 수행하는 것을 이온 크로마토그래피[IC]라고 합니다.

등용매(Isocratic) 용리*

용리 과정에서 이동상의 조성이 일정하게 유지되는 과정입니다.

액체 크로마토그래피*[LC]

액체 형태의 이동상이 사용되는 분리 기술입니다. 액체 크로마토그래피는 컬럼 또는 평면에서 수행할 수 있습니다[TLC 또는 종이 크로마토그래피]. 더 작은 입자와 더 높은 주입구 압력을 사용하는 최신 액체 크로마토그래피는 1970년에 고성능(또는 고압) 액체 크로마토그래피[HPLC]라는 이름으로 명명되었습니다. 2004년에는 초고성능 액체 크로마토그래피의 등장으로 LC의 성능이 극적으로 발전했습니다[UPLC 기술 참조].

이동상*[용리액, 용리액 참조]

고정상 흡착 베드의 길이를 따라 일정한 방향으로 스며드는 유체입니다. 이동상은 액체[액체 크로마토그래피] 또는 기체[기체 크로마토그래피] 또는 초임계 유체[초임계 유체 크로마토그래피]일 수 있습니다. 기체 크로마토그래피의 이동상에는 운반 가스라는 표현을 사용할 수 있습니다. 용리 크로마토그래피의 이동상은 용리액이라고 합니다. 용리액이라는 단어는 sorbent 베드를 통과하며 용액의 관심 화합물을 포함하는 이동상 부분으로 정의됩니다.

순상 크로마토그래피*

고정상이 이동상보다 극성이 강한 용리 절차입니다. 이 용어는 역상 크로마토그래피와 대비시키기 위해 액체 크로마토그래피에서 사용됩니다.

피크*[플레이트 수 참조]

컬럼에서 단일 성분이 용리되는 동안 검출기 반응을 기록하는 차등 크로마토그램 부분입니다. 분리가 불완전하면 둘 이상의 성분이 하나의 미분해 피크로 용리될 수 있습니다. 띠 넓어짐을 최소화하는 시스템의 충전이 잘 된 효율적인 컬럼에서 최적의 조건으로 용리되는 피크는 가우스 분포의 형태에 접근합니다. 정량화는 일반적으로 [베이스라인과 피크 곡선으로 둘러싸인] 피크 면적을 측정하는 방법으로 수행합니다. 드물게 피크 높이[피크 정점에서 베이스라인까지 측정한 거리]가 정량화에 사용될 수도 있습니다. 이 절차에서는 피크 너비와 피크 모양이 모두 일정하게 유지되어야 합니다.

플레이트 수*[N, 효율성 참조]

컬럼 성능을 나타내는 값입니다[기계적 분해능 또는 효율을 나타내며 플레이트 카운트(plate count), 이론적 플레이트 수(number of theoretical plates 또는 theoretical plate number)라고도 함]. 이는 피크의 머무름 크기를 해당 너비와 연결합니다[분산 또는 띠 넓어짐]. 플레이트 카운트를 계산하기 위해 피크를 가우스 분포[통계적 종 모양 곡선]로 나타낼 수 있다고 가정합니다. 변곡점[피크 높이의 60.7%]에서 가우스 곡선의 너비는 평균[피크 정점에 위치]에 대한 표준 편차[σ]의 두 배입니다. 그림 U에서 볼 수 있듯이 피크 높이의 다른 부분에서 측정된 가우스 곡선의 피크 너비는 정확하게 정의된 σ의 배수로 표현될 수 있습니다. 피크 머무름[머무름 부피, V_R 또는 머무름 시간, t_R]과 피크 너비는 N이 무차원 숫자이므로 동일한 단위로 표현해야 합니다. N을 계산하는 5-시그마 방법은 피크 비대칭의 영향을 더 많이 받기 때문에 컬럼 균질성과 성능을 나타내는 보다 엄격한 척도입니다. 컴퓨터 데이터 스테이션은 분리된 각 피크를 자동으로 그리고 해당 플레이트 수를 계산할 수 있습니다.

분취용 크로마토그래피

액체 크로마토그래피를 사용하여 추가 실험이나 사용에 충분한 양과 순도 수준으로 화합물을 분리하는 과정입니다. 제약 또는 생명공학 정제 공정의 경우, 수 킬로그램의 재료에 직경이 수십 센티미터인 컬럼을 사용할 수 있습니다. 몇 마이크로그램의 귀중한 천연 생성물을 분리하는 데는 분석용 HPLC 컬럼으로 충분합니다. 둘 다 분취용 크로마토그래피 방식으로, 스케일만 다릅니다[HPLC 스케일 섹션과 표 A 참조].

분리능*[Rs, 선택성 참조]

해당 머무름 시간의 차이로 표시되는 두 피크의 분리를 베이스라인에서의 평균 피크 너비로 나눈 값입니다. R_s = 1.25는 너비가 동일한 두 개의 피크가 베이스라인에서 분리되었음을 나타냅니다. R_s = 0.6인 경우, 크로마토그램에 두 개의 피크가 있음을 시각적으로 나타내는 유일한 표시는 피크 정점 근처의 작은 노치입니다. 고효율 컬럼은 더 좁은 피크를 생성하고 까다로운 분리 작업에서 분리능을 개선합니다. 그러나 분리능은 N의 제곱근만큼만 증가합니다. 분리능을 높이는 가장 강력한 방법은 크로마토그래피 분리에 사용되는 이동상/고정상 조합을 변경하여 선택성을 높이는 것입니다[화학적 분리능 섹션 참조].

머무름 계수*[k]

샘플 성분이 이동상에 있는 시간과 고정상에 있는 시간을 비교 측정한 것입니다. 샘플 성분이 이동상의 속도로 컬럼을 통과하는 데 걸리는 시간에 비해 고정상에 의해 시간이 얼마나 지연되는지를 나타냅니다. 수학적으로 이것은 조정된 머무름 시간[부피]과 유지 시간[부피]의 비율입니다[k = t_R’/t_M[머무름 시간 및 선택성 참조]].

참고: 과거에는 이 용어를 분할 비율, 용량 비율, 용량 계수 또는 질량 분포 비율로 표시하기도 했으며 기호 k’로 나타냈습니다.

머무름 시간*[tR]

용리 시작[일반적으로 HPLC에서 주입 또는 샘플 주입 순간]과 피크 최대값이 나타나는 지점 사이의 시간입니다. 조정된 머무름 시간 t_R'은 t_R에서 유지 시간[t_M, 주입에서 완전히 잔류하지 않은 분석물의 피크 최대값 용리까지의 시간]을 빼는 방법으로 계산합니다.

역상(Reversed-Phase) 크로마토그래피*

이동상이 고정상(예: 알킬 사슬이 접근 가능한 표면에 화학적으로 결합된 미세 다공성 실리카 기반 물질)보다 훨씬 더 극성이 강한 액체 크로마토그래피에서 사용되는 용리 절차입니다. 참고: 역상(reverse phase)은 잘못된 표현이므로 사용하지 마십시오. [역상(Reversed-Phase) 분리 메커니즘에 대한 몇 가지 새로운 개념은 참고 문헌 4를 참조하십시오.]

선택성[분리 계수, σ]

분리 시스템을 구성하는 특정 이동상과 고정상에서 한 쌍의 분석물의 상대적 열역학적 친화도 차이의 크기를 설명하는 데 사용되는 용어입니다. 적절한 용어는 분리 계수[σ]입니다. 이는 머무름 계수 k2/k1의 비율과 같습니다[머무름 계수 참조]. 정의에 따라 σ는 항상 ≥ 1입니다. σ = 1이면 두 피크가 동시에 용리되고 분리가 이루어지지 않습니다. 분취용 크로마토그래피에서는 최고의 샘플 주입량과 처리량을 위해 α를 최대화하는 것이 중요합니다. [화학적 분리능 섹션 참조]

감도*[S]

검출기에 들어가는 이동상 물질의 단위 농도 또는 단위 질량당 신호 출력입니다(예: 선형 검량선의 그래디언트[검출기 참조]). 농도에 민감한 검출기[예: UV/VIS 흡광도]의 경우 감도는 피크 높이 대 피크의 분석물 농도의 비율입니다. 질량 흐름에 민감한 검출기의 경우에는 피크 높이 대 단위 질량의 비율입니다. 감도가 고유한 특성이 되려면 배율 계수가 아닌 화학적 측정 프로세스에만 의존해야 합니다.

분석물을 검출[정성화]하거나 측정[정량화]하는 능력은 많은 기기 및 화학적 요인에 의해 좌우됩니다. 고효율 컬럼에서 용리되는 잘 분리된 피크[최대 선택성][최대 피크 높이에 대해 대칭성이 우수한 좁은 피크 너비]와 우수한 검출기 감도 및 특이성을 갖추는 것이 가장 이상적입니다. 최대 감도를 얻으려면 분리 시스템의 간섭과 전자 부품 노이즈도 최소화해야 합니다.

고체상 추출[SPE]

LC 원리를 사용하여 소형 크로마토그래피 베드에 적용된 복잡한 매트릭스에서 분석물을 분리, 농축 및/또는 정제하는 샘플 전처리 기술입니다. 오프라인 SPE는 원활한 흐름을 위한 낮은 양압 또는 진공을 사용하여 개별 플라스틱 카트리지 또는 마이크로 용리 플레이트 웰에서 더 큰 입자[수동 또는 자동화를 통해]로 수행됩니다. 온라인 SPE는 더 높은 압력을 이용해 소형 HPLC 컬럼에서 더 작은 입자로 수행되며, 밸브를 사용하여 SPE 컬럼 온라인을 기본 HPLC 컬럼으로 전환하거나, 필요에 따라 오프라인에서 폐기물로 전환합니다.

SPE 방법은 계단식(step) 그래디언트[그래디언트 참조]를 사용하여 베드 컨디셔닝, 샘플 로딩, 세척 및 용리 단계를 수행합니다. 샘플은 일반적으로 중요한 분석물의 k가 최대한 높은 조건에서 로드되므로 로드 및 세척 단계에서 샘플이 완전하게 유지됩니다. 그런 다음 훨씬 더 강한 용매 혼합물로 전환하여 용리를 수행합니다[용리 강도 참조]. 목표는 매트릭스 간섭을 제거하고 후속 분석에 적합한 농도로 용액에서 분석물을 분리하는 것입니다.

속도[효율성, 유속, 분리능 참조]

부피와 입자가 작은 분석 컬럼 또는 부피와 입자가 큰 분취 컬럼을 사용하여 높은 선형 속도에서 LC 분리를 수행할 때 얻을 수 있는 이점입니다. LC 속도에서 자릿수가 달라지는 기술적 진보는 1972년[6000psi에서 정확한 이동상 흐름을 전달할 수 있는 10μm 입자 및 펌프 사용], 1976년[500mL/min의 유속에서 작동하는 75μm 분취 컬럼], 2004년[UPLC 기술 도입 - 15,000psi에서 작동하는 1.7μm 입자 컬럼]에 이루어졌습니다.†

고속 분석용 LC 시스템은 유체역학 전반에 걸쳐 더 높은 압력을 감당해야 할 뿐만 아니라, 주입기 주기 시간이 짧아야 합니다. 그래디언트 믹서는 샘플 간에 빠른 전환이 가능해야 하며, 검출기 센서는 용리액 조성의 작은 변화에 신속하게 반응해야 하고, 데이터 시스템은 좁은 피크를 정확하게 플롯하고 정량화하는 데 필요한 초당 수십 개의 포인트를 수집해야 합니다.

분리능이 높고, 속도가 빠르고, 컬럼 효율이 우수할수록 높은 처리량을 제공하므로 하루에 더 많은 샘플을 분석할 수 있습니다. 실행당 또는 공정 기간별로 더 많은 양의 화합물을 정제할 수 있습니다.

고정상*

크로마토그래피 시스템을 구성하는 두 가지 상 중 하나입니다. 고체, 겔 또는 액체 형태일 수 있습니다. 액체인 경우 고체에 분산시킬 수 있습니다. 고체는 분리 과정에 기여하거나 기여하지 않을 수 있습니다. 액체는 또한 고체에 화학적으로 결합되거나[결합상] 또는 그 위에 고정화될 수 있습니다[고정상].

크로마토그래피 베드 또는 sorbent라는 표현이 고정상이 사용되는 다양한 형태를 나타내기 위해 일반적인 용어로 사용될 수 있습니다.

LC에서 이동상을 나타내기 위해 액체상이라는 용어를 사용하는 것은 권장되지 않습니다. 고정상을 액체상[대부분 고체 지지체에 코팅된 액체]이라고 부르는 기체 크로마토그래피와의 혼동을 피하기 위함입니다.

개방형 컬럼 액체-액체 분할 크로마토그래피[LLC]는 HPLC로 잘 전환되지 않아 결합상 충전재를 사용하여 이를 대체했습니다. LLC는 고정상-액체 코팅이 고체 지지체에서 흘러나와 섞이지 않는 액체 이동상을 오염시키는 문제로 인해 최신 검출기와 호환되지 않는 것으로 확인되었습니다.

UPLC 기술

Sub 2μm의 입자와 매우 높은 작동 압력을 수용하도록 전체적으로 설계된 고효율 LC 시스템을 사용하는 방식을 초고성능 액체 크로마토그래피[UPLC 기술]라고 합니다.† 이 기술의 주요 이점은 기존 HPLC 분리에서 볼 수 있는 분리능을 유지하면서 HPLC에 비해 분리능이 크게 향상되고 실행 시간이 빠르다는 것입니다.

†자세한 내용은 https://www.waters.com/uplc를 참조하십시오.