액체 크로마토그래피 입문자 가이드

기본적인 고성능 액체 크로마토그래피[HPLC] 시스템의 구성 요소를 그림 E의 단순화시킨 다이어그램에서 볼 수 있습니다.

저장 용기에는 용매[움직이기 때문에 이동상이라고 함]가 담깁니다. 고압 펌프[용매 이송 시스템 또는 Solvent Manager]는 일반적으로 분당 밀리리터 단위로 지정된 이동상의 유속을 생성하고 측정하는 데 사용됩니다. 주입기[Sample Manager 또는 자동 샘플 주입기]는 샘플을 HPLC 컬럼으로 운반하는 연속적으로 흐르는 이동상 스트림에 샘플을 도입[주입]할 수 있습니다. 컬럼에는 분리에 필요한 크로마토그래피 충전재가 들어 있습니다. 이 충전재는 컬럼 하드웨어에 의해 제자리에 고정되기 때문에 고정상이라고 합니다. HPLC 컬럼에서 용리되는 분리된 화합물 띠를 보려면 검출기가 필요합니다[대부분의 화합물은 색상이 없으므로 눈으로 확인할 수 없음]. 이동상은 검출기를 빠져나와 필요에 따라 폐기물로 보내지거나 수집될 수 있습니다. 이동상에 분리된 화합물 띠가 포함된 경우 HPLC는 추가 연구를 위해 정제된 화합물을 포함하는 용리액의 이 분획을 수집할 수 있습니다. 이것을 분취용 크로마토그래피[HPLC 스케일 섹션에서 논의]라고 합니다.

펌프, 주입기, 컬럼 및 검출기 구성 요소를 상호 연결하여 이동상, 샘플 및 분리된 화합물 띠를 위한 도관을 구성하기 위해 고압 튜브와 피팅이 사용됩니다.

검출기는 HPLC 시스템 구성 요소인 컴퓨터 데이터 스테이션에 연결됩니다. 여기서 디스플레이에 크로마토그램을 생성하고 샘플 성분의 농도를 식별 및 정량화하는 데 필요한 전기 신호를 기록합니다(그림 F 참조). 샘플 화합물의 특성은 매우 상이하기 때문에 여러 유형의 검출기가 개발되었습니다. 예를 들어, 화합물이 자외선을 흡수할 수 있는 경우 UV 흡광도 검출기가 사용됩니다. 화합물이 형광을 나타내면 형광 검출기가 사용됩니다. 화합물에 이러한 특성이 모두 없는 경우 증기화 광산란 검출기[ELSD]와 같은 보다 보편적인 검출기가 사용됩니다. 가장 강력한 방식은 여러 검출기를 직렬로 사용하는 것입니다. 예를 들어, UV 및/또는 ELSD 검출기를 질량분석기[MS]와 함께 사용하여 크로마토그래피 분리 결과를 분석할 수 있습니다. 이는 단일 주입을 통해 분석물에 대한 보다 종합적인 정보를 제공합니다. 질량분석기를 HPLC 시스템에 연결하는 방식을 LC-MS라고 합니다.

HPLC 작동

그림 G의 다이어그램을 보면 샘플에 포함된 화합물을 분리하는 방식을 보다 쉽게 이해할 수 있습니다.

이동상은 왼쪽에서 컬럼으로 들어가고 입자층을 통과하여 오른쪽으로 나옵니다. 흐름 방향은 녹색 화살표로 표시됩니다. 먼저 상단 이미지를 살펴보겠습니다. 이것은 샘플이 컬럼에 들어가 띠를 형성하기 시작할 때인 시간 0[주입 순간]에서의 컬럼을 나타냅니다. 여기에 표시된 샘플은 노란색, 빨간색 및 파란색 염료의 혼합물로, 컬럼 주입구에서 하나의 검정색 띠로 나타납니다. [실제로 이 샘플은 용매에 용해될 수 있는 어떤 것이든 될 수 있습니다. 일반적으로 화합물은 무색이고 컬럼 벽은 불투명하므로 분리된 화합물이 용리될 때 이를 확인하기 위해 검출기가 필요합니다.]

이동상이 충전재 입자를 통해 몇 분 동안 지속적으로 꾸준히 흐르면[아래 이미지] 개별 염료가 서로 다른 속도로 별도의 띠를 형성하면서 이동했음을 알 수 있습니다. 이것은 이동상과 고정상 사이에 경쟁적으로 각각의 염료나 분석물을 끌어들이기 때문에 생기는 현상입니다. 노란색 염료 띠가 가장 빠르게 움직이며 곧 컬럼에서 용리됩니다. 노란색 염료는 다른 염료보다 이동상을 더 오래 머무릅니다[더 강하게 끌림]. 따라서 이동상의 속도에 가까운 빠른 속도로 이동합니다. 파란색 염료 띠는 이동상보다 충전재에 더 끌립니다. 입자에 더 강하게 끌리기 때문에 이동 속도가 상당히 느려집니다. 즉, 이 샘플 혼합물에서 가장 오래 머무르는 화합물입니다. 빨간색 염료 띠는 이동상에 대해 중간의 끌림을 가지므로 컬럼에서 중간 속도로 이동합니다. 각 염료 띠는 다른 속도로 움직이기 때문에 크로마토그래피 원리에 따라 분리할 수 있습니다.

검출기 개요

분리된 염료 띠가 컬럼을 나가면 즉시 검출기로 전달됩니다. 검출기에는 이동상의 백그라운드에 대비시켜 분리된 각 화합물 띠를 관찰[검출]하는 플로우 셀이 들어 있습니다[그림 H 참조]. [실제로, 일반적인 HPLC 분석 농도에서 많은 화합물의 용액은 무색입니다.] 적절한 검출기는 화합물의 존재를 감지하고 해당 전기 신호를 컴퓨터 데이터 스테이션으로 보낼 수 있습니다. 여러 가지 유형의 검출기를 선택할 수 있는데, 앞서 논의한 바와 같이 분리 및 분석해야 하는 화합물의 특성 및 농도를 고려하여 결정됩니다.

크로마토그램 개요

크로마토그램은 HPLC 시스템에서 화학적으로[크로마토그래피 원리에 따라] 이루어지는 분리를 나타냅니다. 베이스라인에서 상승하는 일련의 피크가 시간 축을 따라 그려집니다. 각 피크는 다른 화합물에 대한 검출기 반응을 나타냅니다. 크로마토그램은 컴퓨터 데이터 스테이션에서 그래프로 그려집니다[그림 H 참조].

그림 H에서 노란색 띠는 검출기 플로우 셀을 완전히 통과했고, 생성된 전기 신호는 컴퓨터 데이터 스테이션으로 전송되었습니다. 크로마토그램 결과가 화면에 그려지기 시작합니다. 크로마토그램은 샘플이 처음 주입될 때 시작되고 화면 하단 근처에 설정된 직선으로 시작됩니다. 이것을 베이스라인이라고 합니다. 시간이 지남에 따라 여기에 플로우 셀을 통과하는 순수한 이동상이 나타납니다. 노란색 분석물 띠가 플로우 셀을 통과하면 더 강한 신호가 컴퓨터로 전송됩니다. 샘플 띠의 노란색 염료 농도에 비례하여 위쪽으로 향했다가 아래로 내려오는 곡선이 형성됩니다. 이렇게 크로마토그램에 피크가 생성됩니다. 노란색 띠가 검출기 셀을 완전히 통과하면 신호 레벨이 베이스라인으로 돌아갑니다. 이제 플로우 셀에는 다시 한 번 순수한 이동상만 들어 있게 됩니다. 노란색 띠가 가장 빠르게 이동하여 컬럼에서 먼저 용리되므로 이 피크가 가장 먼저 그려집니다.

잠시 후 빨간색 띠가 플로우 셀에 도달합니다. 빨간색 띠가 먼저 셀에 들어감에 따라 베이스라인에서 신호가 상승하고 빨간색 띠를 나타내는 피크가 그려지기 시작합니다. 이 다이어그램에서 빨간색 띠는 플로우 셀을 완전히 통과하지 않았습니다. 이 순간에 프로세스를 멈출 경우 다이어그램은 빨간색 띠와 빨간색 피크가 어떤 모습인지를 보여줍니다. 대부분의 빨간색 띠가 셀을 통과했기 때문에 실선과 같이 대부분의 피크가 그려졌습니다. 다시 시작할 수 있다면 빨간색 띠가 플로우 셀을 완전히 통과하고 빨간색 피크가 완성될 것입니다[점선]. 가장 머무름 특성이 강한 파란색 띠는 가장 느리게 이동해 빨간색 띠 다음으로 용리됩니다. 점선은 실행을 끝까지 계속했다면 완성되었을 크로마토그램의 모습을 보여줍니다. 흥미롭게도, 파란색 분석물 띠의 너비는 컬럼에서 가장 좁지만 컬럼에서 용리됨에 따라 가장 넓어지기 때문에 파란색 피크의 너비가 가장 넓습니다. 이는 크로마토그래피 충전재 베드를 통해 더 천천히 이동하고 완전히 용리되는 데 더 많은 시간[및 이동상의 양]이 필요하기 때문입니다. 이동상은 일정한 속도로 계속 흐르기 때문에 이것은 파란색 띠가 넓어지고 옅어짐을 의미합니다. 검출기는 띠의 농도에 비례하여 반응하기 때문에 파란색 피크는 높이가 낮지만 너비가 더 넓습니다.