융합 크로마토그래피 입문자 가이드

본 챕터에서는 먼저 CC 분석에서 사용되는 용어를 검토한 후 어떤 유형의 샘플과 분석물이 ACQUITY UPC² 시스템에 의해 분석될 수 있는지 설명합니다. 보조 용매(co-solvent), 이동상 첨가물, 샘플 희석액의 역할, 그리고 압력과 온도가 밀도에 미치는 영향, 및 이것이 분리에 미치는 영향을 설명합니다. 마지막으로, 분석법 개발을 위한 일반적인 프로토콜을 소개합니다.

용어

앞서 설명한 바와 같이, CC는 RPLC와 유사하지만 약용매(이동상 A)로 물 대신 압축성 CO₂를 사용합니다. 용매, 보조 용매(co-solvent) 또는 변형제와 같은 기존의 용어는 모두 강한 용리 용매인 이동상 B의 주요 액체 성분을 나타냅니다. 일반적으로 CC 분석에서 보조 용매(co-solvent)는 메탄올이지만 에탄올, 이소프로파일 알코올, 아세토니트릴 또는 이들의 조합과 같은 다른 유기 용매인 경우도 있습니다. 첨가물은 피크 모양 및/또는 분석물 용해도 향상을 위해 저농도로 보조 용매(co-solvent)에 첨가되는 염 또는 액체입니다. 첨가물은 또한 크로마토그래피 선택성에 영향을 미칠 수 있습니다. 대표적인 첨가물로는 디에틸아민, 수산화 암모늄, 포름산, 트리플루오로 아세트산, 포름산 암모늄, 아세트산 암모늄 또는 소량의 물이 있습니다. 적절한 농도는 첨가물에 따라 달라집니다. 예를 들어, 5% 이상의 물 첨가는 다른 분석법 조건을 적절하게 선택하지 않을 경우, 두 개의 상을 갖는 이동상이 형성될 위험을 제기시킵니다.

어떤 새로운 분석 방법론에 대해 처음으로 제기되는 질문 중 하나는 "내 샘플을 이 기술(융합 크로마토그래피)로 분석할 수 있나요?"입니다. 가장 간단한 대답은 샘플을 유기 용매에 용해시킬 수 있다면 CC로 분석 가능하다는 것입니다. 이 질문에 대한 보편적인 대답은 없으며, 확인을 위해 몇 가지 실험적인 작업이 필요합니다. 많은 샘플 전처리 기술이 유기 용매에서 샘플을 생성(예: 액체/액체 추출, 고상 추출, 단백질 침전)하기 때문에 유기 주입 용매와의 이러한 호환성은 매우 편리합니다. CC가 정말 좋은 점은 유기 용매에서 이러한 샘플을 ACQUITY UPC² 시스템에 직접 주입할 수 있고, RPLC에서 종종 필요한 번거롭고 시간 소모적인 증발 단계 또는 재구성 단계가 필요하지 않는 다는 것입니다. 챕터 5에서는 이 주제를 보다 상세하게 다룹니다. 분석 과학자의 경우, 샘플에 대해 가능한 많을 것을 파악하는 것이 언제나 도움이 됩니다(그림 23). 더 많이 알수록 견고한 분석법을 개발할 가능성이 더 커지기 때문입니다. 다양한 유기 용매에서 화합물의 용해도에 관한 유용한 정보 중 하나는 분배 계수(P)(일반적으로 log₁₀ P라고 함)와 관련이 있습니다. 분배 계수(P)는 일반적으로 물과 1-옥탄올처럼 평형 상태에서 혼화되지 않은 두 용매의 두 혼합물 상에 대한 화합물의 농도 비율을 나타냅니다(그림 24). 이러한 계수는 이 두 용매 간에 화합물의 차분 용해도를 나타내는 척도입니다. 분배 계수는 화합물이 얼마나 친수성 또는 소수성인지를 측정합니다.

CC의 측면에서 분배 계수는 표적 화합물이 ACQUITY UPC² 시스템으로 분석할 후보인지 여부를 결정하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 대략적인 규칙으로, log P 값이 2와 9 사이인 화합물이 CC에 적합한 후보입니다.

융합 크로마토그래피의 보조 용매(co-solvent)

보조 용매(co-solvent)는 두 가지 역할을 합니다. 첫째, 보조 용매(co-solvent)는 CO₂의 용매력에 영향을 미칩니다. 둘째, 보조 용매(co-solvent)는 분석물과 고정상 사이의 상호 작용에 영향을 미칩니다. 보조 용매(co-solvent)를 변경(예: 메탄올에서 아세토니트릴로 변경)하면 머무름과 선택성 모두에 영향을 미칩니다. CC에서 보조 용매(co-solvent)의 역할은 역상 LC에서 강용매의 역할과 유사하며, CO₂만으로도 비슷하게 헵탄의 용리 강도를 갖습니다.

챕터 1의 표 1은 다양한 유기 용매에 대한 용리(용리 강도) 서열을 나타내며, CC에 사용되는 가장 일반적인 4가지 보조 용매(co-solvent)인 아세토니트릴, 이소프로파일 알코올, 에탄올, 메탄올을 보여줍니다. 나열된 용매는 모두 CO₂와 혼화되기 때문에 얻을 수 있는 머무름과 용리 강도의 범위가 넓습니다.

CO₂ 이동상에 첨가된 보조 용매(co-solvent)는 일반적으로 분석물의 머무름 시간을 감소시킵니다. 보조 용매(co-solvent)의 농도가 증가하면 이동상의 극성이 변화하여 머무름 시간을 감소시킵니다. 그림 25는 보조 용매(co-solvent) 농도의 변화가 등용매 분리에서 머무름에 미치는 영향을 나타냅니다. 강한 용리성 보조 용매(co-solvent)(메탄올)의 농도가 낮아질수록 분석물의 머무름이 증가합니다. 이는 RPLC에서 관찰된 것과 같은 현상입니다.

그림 26은 다양한 보조 용매(co-solvent)에 따라 이동상 강도가 변화하는 양상을 나타냅니다. 메탄올은 가장 강한 보조 용매(co-solvent)이며, 분석물을 가장 빠르게 용리시킵니다. 이소프로파일 알코올은 메탄올보다 약하지만 아세토니트릴보다는 강하며, 아세토니트릴은 CC에서 세 가지 보조 용매(co-solvent) 중 가장 약하여 분석물을 가장 오래 머무르게 합니다. 다른 크로마토그래피 모드에서도 동일한 형태의 크로마토그래피 양상이 나타납니다. 즉, 강한 용매일수록 머무름이 적어지고, 분석물이 더 빠르게 용리됩니다.

CC에서 서로 다른 보조 용매(co-solvent)를 혼합하여 용매 강도의 변화에 따라 머무름의 차이를 만들어낼 수 있습니다. 그림 27은 메토클로프라미드 및 관련 불순물의 그래디언트 분리를 위해 메탄올에 더 약한 보조 용매(co-solvent)(아세토니트릴)를 첨가한 효과를 나타냅니다. 아세토니트릴 농도가 증가함에 따라 메탄올의 농도, 따라서 용매 강도가 감소하며 머무름 시간의 증가가 관찰됩니다. 이 분리에서 다른 보조 용매(co-solvent)의 사용으로 선택성이 약간 변하고 분리능이 개선되며 피크가 선명해지는 결과가 얻어집니다.

융합 크로마토그래피의 첨가물

RPLC에서와 같이 CC에 첨가물을 넣으면 분리의 피크 모양 및/또는 분리능이 향상됩니다. 그림 27에는 네 가지 크로마토그램 모두에서 포름산 암모늄을 모든 보조 용매(co-solvent) 혼합물에 첨가한 효과가 나와 있습니다. 첨가물은 고정상 표면을 변형시키거나 이온 쌍으로 작용하여 선택성을 변화시킬 수 있습니다. 염기성 첨가물은 염기성 화합물에서 피크 모양을 개선하고 선택성을 약간 변화시킬 수 있습니다. 염기성 첨가물의 예로는 수산화 암모늄, 2-프로파일아민, 트리에틸아민이 있습니다. 산성 첨가물은 산성 화합물의 피크 모양을 개선하고 선택성을 변화시킬 수 있습니다. 일반적인 산성 첨가물에는 트리플루오로 아세트산, 포름산, 아세트산이 있습니다. 그림 28은 산성 분석물의 분리를 보여주며, 이 예에서 알 수 있듯이, 산성 첨가물의 농도를 증가시키면 피크 모양이 개선됩니다.

어떤 첨가물을 사용하는지에 따라 피크 모양과 머무름에 현저한 차이를 만들 수 있습니다(그림 29). 이러한 염기성 분석물(베타 차단제)의 경우 첨가물이 없이 메탄올 보조 용매(co-solvent)만 사용했을 때 선명하게 분리된 피크를 얻기 어렵습니다. 포름산의 첨가는 실제로 피크 모양을 악화시킵니다. 포름산은 또한 220nm의 검출 파장에서 흡수되어 베이스라인을 기울어지게 만듭니다. 염기성 첨가물을 사용하면 염기성 화합물 피크 모양이 개선되는 경우가 많기 때문에 이러한 강염기의 경우, 아세트산 암모늄(20mM)을 첨가하면 디에틸아민과 마찬가지로 피크 모양이 크게 개선됩니다.

융합 크로마토그래피의 샘플 희석액

광범위한 샘플 희석액이 CC와 호환되지만 우수한 피크 모양을 얻기 위해서는 적절한 희석액을 선택해야 하는 경우가 있습니다. 샘플 희석액 강도는 CC의 피크 모양과 용해도에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 다른 크로마토그래피 모드와 마찬가지로 분석물 용해도와 피크 모양의 균형을 제공하는 약한 샘플 희석액(가능한 한 약한)의 사용을 권장합니다. CC에서 이는 샘플이 용리 서열(표 1)의 위쪽에 있는 유기 용매에 용해되어야 한다는 것을 의미합니다. Waters에서는 용해도(이소프로파일 알코올)와 피크 모양(헵탄)의 균형을 유지시키는 우수한 일반 용매로 헵탄/2-프로판올(90:10)의 사용을 권장합니다. 샘플의 수분 함량을 줄이거나, 가능하면 없애는 것이 좋습니다. 그림 30은 중성 화합물 부틸파라벤에 대한 7가지 크로마토그램 피크의 오버레이입니다. 주입 부피가 증가할수록 주입 용매 강도가 피크 모양에 미치는 영향이 나타납니다. 강한 보조 용매(co-solvent)인 메탄올에서 주입 부피가 증가함에 따라 피크 프런팅(Fronting) 현상이 발생합니다. 약한 보조 용매(co-solvent)인 이소프로파일 알코올은 메탄올에 비해 피크 프런팅(Fronting) 현상이 적고 약간 높은 피크를 보입니다. 권장되는 샘플 희석액인 이소프로파일 알코올/헥산은 모든 주입 부피에서 또렷하고 대칭적인 피크를 제공합니다.

압력, 온도 및 밀도

자동 역압 조정기(ABPR) 설정은 압축된 CO₂의 밀도를 변경시켜 머무름 시간에 영향을 미칩니다. ABPR 압력 설정이 증가할수록 밀도는 증가하지만 머무름 시간은 감소합니다. 이동상 조성이 분리에 큰 영향을 미치기는 하지만 압력을 조정하고 이동상의 밀도를 조절하여 분석법을 미세 조정할 수 있습니다. 그림 31은 다른 모든 파라미터는 그대로 두고 ABPR 설정(압력)을 증가시키면 머무름 시간이 감소한다는 것을 나타냅니다.

 RPLC에서와 같이, 컬럼 온도는 CC 분석의 선택성과 머무름 모두에 영향을 미치며, 분석물마다 서로 다른 정도로 영향을 받습니다. 컬럼 온도가 증가하면 분석물 분자의 에너지가 증가하며, LC 또는 GC와 마찬가지로 고정상에서의 머무름이 감소하게 됩니다. 그러나 CC에서는 일정한 압력에서 온도가 증가하면 이동상 밀도도 감소하여 용매력이 감소하므로 머무름이 증가하게 됩니다. 따라서 CC에서는 온도 변화가 반대의 효과를 나타냅니다. 대부분의 경우, 컬럼 온도가 증가하면 이동상 밀도가 감소하고 머무름 시간이 증가합니다(그림 32). 50°C에 추가(작은) 피크가 존재한다는 점에도 주목하세요. 이는 약간의 선택성 차이에서 발생된 것인데, 온도가 분석물마다 서로 다른 방식으로 영향을 미치기 때문입니다.

피크 모양, 머무름 및 선택성은 보조 용매(co-solvent), 첨가물, 샘플 희석액, 압력, 온도 및 고정상의 역할을 변화시키고 파악함으로써 조절할 수 있습니다. 이 챕터에서 설명한 내용을 결부시켜 표 5에 이러한 도구를 통해 CC 분리가 어떻게 향상되는지를 나타내었습니다. 그러나 주어진 분리에서 각 파라미터의 중요도는 다를 수 있다는 것을 유념해야 합니다. 예를 들어, 경우에 따라서는 선택성을 조절하는 목적에서 보조 용매(co-solvent)의 선택보다는 고정상이 더 큰 역할을 하기도 합니다. 또 다른 상황으로, 컬럼 케미스트리를 변경하는 것보다 메탄올에서 50:50 메탄올/아세토니트릴로 전환하는 것이 더 큰 효과를 나타내게 됩니다.

일반 분석법 개발 프로토콜 - 접근 방식 1

그림 33은 CC와 호환되는 주입 용매에 샘플이 용해될 수 있는지 여부를 신속하게 결정하기 위한 프로토콜입니다. 분석물의 log P가 -2와 9 사이의 값이면 용해될 수 있습니다. 분석물의 log P 값이 -2 미만이면 수용성 용매에만 용해되므로 CC와는 호환되지 않을 수 있습니다. 분석물의 log P 값을 알 수 없는 경우에는 주입에 앞서 적절한 유기 용매에 용해시켜야 합니다. 융합 크로마토그래피는 메탄올과 같은 용매가 매우 강한 용매(역상 LC에서는 반대로 상당히 양한 용매)로 작용하는 순상 분리처럼 동작한다는 점에 유념해야 합니다.

따라서, 샘플은 헵탄/이소프로파일 알코올과 같은 보다 약한 용매에 용해(또는 희석)시켜야 합니다. 샘플 용해도와 피크 모양 간에 균형을 이루어야 합니다. CC에서 피크 모양에 미치는 샘플 희석액의 영향은 이 챕터 앞부분에 소개되어 있습니다.

샘플 희석액의 선택 외에도, 분석법을 개발하기 위해 고려해야 할 여러 요소들이 있습니다. 예를 들어, “어떤 크로마토그래피 조건이 해당 분석물에 적합한가?”라는 것입니다. 그림 34는 광범위한 분석물을 유지하고 분리하는 것으로 알려진 일반적인 권장 조건으로, 이를 시작 조건으로 삼으면 좋습니다. 다른 크로마토그래피 모드와 마찬가지로, 이러한 조건들은 모든 경우에 적절한 것은 아니며, 피크 모양을 개선하고 선택성과 머무름을 변화시키기 위한 전략을 채택할 수 있습니다.

이러한 경우 그림 35, 36, 37은 피크 모양 개선, 머무름 변화 및 선택성 변화를 위한 체계적인 접근 방식을 나타내며, 역상 LC에 사용되는 접근 방식과 크게 다르지 않습니다. 그림 35는 피크 모양을 향상시키기 위한 프로토콜을 나타냅니다. 초기 출발점은 대상 분석물이 주로 염기성인지 산성인지에 따라 권장되는 조건들입니다. 산성 화합물은 산성 조건에서 더 나은 피크 모양을 나타내는 경향이 있고, 염기성 화합물은 염기성 조건에서 더 나은 피크 모양을 나타내는 경향이 있습니다. 피크 모양을 개선하기 위한 전략으로는 다른 첨가물 사용, 첨가물 농도 변경, 컬럼 케미스트리 변경 등이 있습니다.

그림 36은 머무름을 증가시키기 위한 프로토콜을 나타냅니다. 모든 형태의 액체 크로마토그래피와 마찬가지로, 첫 번째 옵션은 다른 (약한) 보조 용매(co-solvent)를 사용하는 것입니다. 메탄올은 CC에서 사용되는 가장 강력한 보조 용매(co-solvent)이며, 아세토니트릴이나 다른 알코올과 같은 약한 보조 용매(co-solvent)를 사용하면 컬럼의 머무름 시간이 늘어납니다. 그래디언트의 기울기를 평평하게 하거나 감소시키는 방법(보조 용매(co-solvent)의 최종 비율을 낮추거나 그래디언트 지속 시간을 증가시킴)도 효과적일 수 있습니다. 보조 용매(co-solvent)를 혼합하고 메탄올의 농도를 감소시키면 전체적인 보조 용매(co-solvent)의 강도가 약해져 머무름 시간이 증가합니다. 컬럼에서 이동상의 밀도를 조절할 수 있다는 것은 SFC와 CC에 고유한 특징입니다. 이렇게 하면 밀도가 낮을수록 머무름이 증가하므로 전체적인 머무름이 변합니다. 이를 위해 ABPR 설정을 낮추거나 온도를 증가시키는 방법이 이용됩니다. 마지막으로, 다른 컬럼 케미스트리를 사용하는 것도 머무름을 증가시키는 또 다른 전략입니다.

그림 37은 분리의 선택성(용리 순서, 상대적 머무름)을 변경하기 위한 프로토콜을 나타냅니다. 메탄올 대신 아세토니트릴과 같은 다른 보조 용매(co-solvent)를 사용하는 것 또한 방법이 될 수 있습니다. 알코올 기반의 양성자성 보조 용매(co-solvent)에서 아세토니트릴과 같은 비알코올 기반의 비양성자성 보조 용매(co-solvent)로 변경하면 메탄올을 다른 알코올로 전환하는 것보다 선택성에 훨씬 큰 영향을 미칩니다. 메탄올 농도의 감소는 전체적인 보조 용매(co-solvent) 강도를 약화시키기 때문에, 이는 머무름을 증가시키고 선택성을 변화시킬 수 있습니다. 이동상의 밀도 조절로도 전체적인 분석물의 머무름을 변화시킬 수 있고, 주어진 분리를 최적화하기에 이것으로 충분할 수 있습니다. 이는 밀도 효과가 특정 분석물마다 다를 수 있다는 점을 이용한 것입니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 필요에 따라 컬럼 케미스트리의 변화도 권장합니다.

컬럼 그룹 분석법 개발 전략 프로토콜 - 접근 방식 2

이전 섹션에서 설명한 분석법 개발 프로토콜은 일반적인 출발 조건과 함께, 분리를 미세 조정하는 다양한 이동상 특성의 영향에 초점을 맞추고 있습니다. 본 섹션에서는 키랄 분리와 아키랄 분리를 위한 다른 두 가지 대안을 설명합니다. 이 두 가지 대안 모두 다양한 시험 화합물 그룹에 대해 통계적으로 가장 높은 성공률을 이끌어내는 분석법과 컬럼의 조합을 요구합니다. 일반적으로 말해서, CC 컬럼 선택 과정에서는 "무작위 대입식" 접근이 적용되지만, 본 섹션에서 제안하는 프로토콜은 단계별 전략을 제시합니다.

UPC² Trefoil 컬럼을 이용한 키랄 분리의 분석법 개발 전략

키랄 화합물에 대해 제안되는 선별 프로토콜은 세 가지 Waters UPC² Trefoil 키랄 화학물질인 AMY1, CEL1, CEL2에 기초합니다. 그림 38에 나타낸 선별 프로토콜은 성공률을 대폭 높이는 이러한 네 가지 단계, 네 가지 컬럼의 최적 경로 선별, 및 가장 적합한 보조 용매(co-solvent)의 결합을 권장합니다.

프로토콜에 따라, 에탄올:이소프로판올:아세토니트릴(1:1:1)의 혼합물에 20mM의 초산암모늄을 사용하여 AMY1에서 선별을 시작해야 합니다. 이 분석법으로 원하는 분리가 얻어지지 않으면 다음 분석법으로 0.2% TFA가 포함된 메탄올과 이소프로판올 1:1 혼합물로 CEL1 컬럼을 사용하는 방법을 채택해야 합니다. 자세한 분석법 조건은 그림 38의 상자에 나와 있습니다.

UPC² Torus 컬럼을 이용한 아키랄 분리의 분석법 개발 전략

아키랄 분리를 위한 선별 프로토콜도 유사한 접근 방식을 따릅니다. 이를 위해 아래에 설명된 최대 세 단계를 따를 수 있습니다.

1단계

Torus 2-PIC(3.0 x 100mm) 컬럼을 통해 빠른 스카우트 단계부터 시작하여 크로마토그래피 조건(1.2mL/분, 3분 내 4–50% MeOH, 30°C, 2,000psi BPR)을 따릅니다.

얻어진 결과에 따라 다음과 같이 진행합니다.

1. a) 선택성과 피크 모양 요건이 충족되었는지 확인하고 필요한 경우에만 분석법을 추가로 최적화합니다.
2. b) 양호한 선택성이 얻어졌고 피크 모양 개선이 필요한 경우, 산성의 경우 포름산 또는 염기성의 경우 염기성 첨가물을 넣은 Torus 2-PIC 컬럼으로 분석합니다.
3. c) 데이터에 기초하여 다른 선택성이 필요한 경우 2단계로 진행합니다.

2단계

샘플의 특성에 따라 정의된 선별 유동 경로에 나와 있는 적절한 경로를 선택합니다. 그런 다음 적절한 분리가 이루어질 때까지 제안된 컬럼과 보조 용매(co-solvent) 조합을 사용하여 유동 경로를 따라 계속 진행합니다.

3단계

분리를 미세 조정하기 위해서는 보조 용매(co-solvent) 조성, 온도, 첨가물 및 압력을 조절하여 분리를 향상시킬 수 있습니다. 섹션 4.7의 그림에 이런 식으로 분석법을 개선하는 방법이 나와 있습니다.