융합 크로마토그래피 입문자 가이드

앞서 설명한 바와 같이 융합 크로마토그래피는 선택성 폭이 넓어 다양한 응용이 가능합니다(표 5).

시장 영역이나 테스트 대상 분석물의 정확한 특성에 관계없이 CC는 크게 다음 세 가지 방식으로 분석 과제 해결에 도움을 줍니다:

• 융합 크로마토그래피는 워크플로우를 간소화합니다.
• 융합 크로마토그래피는 구조적 유사성을 가진 화합물을 분리합니다.
• 융합 크로마토그래피는 역상 LC와 직교하는 분리 모드입니다.

다음으로 몇 가지 응용 예를 통해 CC의 주요 이점을 설명합니다.

SFC에서 CC로 발전되면서 이루어진 가장 유용한 발견 중 하나는 압축된 CO₂가 다양한 유기 용매와 혼합되어 이전에는 불가능했던 방식으로 크로마토그래피 분석을 가능하게 한다는 것입니다. 이 섹션에서는 분석 실험실의 워크플로우를 획기적으로 간소화하는 데 CC가 어떤 역할을 할 수 있는지 설명합니다.

일반적인 분석 실험실에서는 초기 샘플 수집부터 최종 분석까지 워크플로우를 간소화하는 것이 가장 효과적인 비즈니스 개선 방법입니다. CC는 많은 응용 분야의 워크플로우를 크게 간소화하여 비용과 시간을 절약하고 오류 가능성을 줄이며 생산성을 높이는 결과를 가져다 줍니다. 이러한 간소화에는 다음이 포함됩니다:

• 다양한 기술의 결합(LC 및 GC)
• 다양한 분석법의 결합(순상 LC 및 역상 LC)
• 샘플 전처리 시간 단축

다중 기술 결합 – 지질 분석

지질 분석은 여러 가지 이유로 중요합니다. 제약 산업에서 지질 프로파일은 대조군 및 투여 대상자에 대한 약물 효능의 영향을 결정하기 위해 연구됩니다.

임상 연구에서 지질 수준은 치료의 효능뿐만 아니라 다양한 질병의 생체 지표로서 연구됩니다. 식품 분야에서는 트리글리세리드와 같은 특정 지질 성분이 영양 목적으로, 또는 생성물의 진위를 결정하기 위해 프로파일링됩니다. 석유 제품(예: 바이오디젤)에서는 화학물질 내의 지방산과 트리글리세리드가 분석됩니다. 원하는 결과에 따라 지질 분석에는 서로 다른 기술이 요구됩니다. GC 분석이 적용되는 유리 지방산의 경우, 특히 긴 탄소 사슬인 경우에 피크 모양과 검출 한계를 개선하기 위해 유리 지방산을 지방산 메틸 에스테르(FAME)로 유도체화해야 합니다. 유도체화는 몇 시간이 소요될 수 있으며, GC 분석에 최대 30분이 소요될 수 있습니다. 인지질 및 스핑고지질과 같은 더욱 극성을 띠는 지질의 경우, 서로 다른 지질 성분을 분리하기 위해 HILIC 또는 순상 LC가 필요한 경우가 많습니다(극성 헤드기의 성질에 기초함). 그런 다음에는, 탄소 사슬 길이 및/또는 이중 결합 수에 기초하여 성분 내에서 더욱 소수성을 띠는 지질들을 표적화하기 위해 역상 LC가 사용됩니다. 확인할 수 있듯이, 완전한 지질 프로파일링을 위해서는 여러 가지 기술이 필요합니다. 단일 주입으로 모든 성분의 지질을 분리하는 CC의 경우는 그렇지 않습니다. 그림 40은 ACQUITY UPC² 시스템을 사용하여 쥐 심장 추출물을 대상으로 실시한 종합적 지질 프로파일링을 나타냅니다. 이 예에서 BEH 컬럼과 일반적인 그래디언트로 서로 다른 지질 성분이 분리되며, 순상 LC 또는 HILIC에 의한 것과 유사한 분리가 얻어집니다.

중성 지질의 경우(즉, 트리글리세리드(TG), 디글리세리드(DG), 콜레스테릴 에스테르(CE), 유리 지방산), 단순히 컬럼과 그래디언트 조건을 변경하는 것만으로 지방산 사슬 길이와 이중 결합 수에 따라 각 성분 내에서 서로 다른 지질들이 유지되고 분리됩니다(그림 41).

CC 분석은 GC 분석보다 빠를 뿐만 아니라(최대 10배 빠름), 유도체화가 필요하지 않으므로 지질 분석을 위한 전체 워크플로우가 크게 간소화됩니다. 유도체화가 없으면 시간이 절약되고 워크플로우에 이러한 단계를 추가할 때 발생할 수 있는 오류를 줄일 수 있습니다. CC 분석을 사용하지 않는다면 이러한 유형의 프로파일링과 표적 분석을 위해 최대 세 가지 다른 기술이 필요할 수 있어 샘플 처리량이 감소하고, 용매 사용량, 분석 시간, 전체 분석 비용이 증가할 수 있습니다.

다중 LC 분석법 결합 – 지용성 비타민

지용성 비타민 분석은 제약 산업, 임상 연구 및 진단, 식품 및 연료 산업에 중요합니다. 지용성 비타민과 카로티노이드의 분석은 일반적으로 역상 또는 순상 LC로 수행됩니다(표 6). 이러한 화합물을 단일 주입으로 분리하는 데는 어려움이 있기 때문에, 서로 다른 컬럼과 이동상을 이용해 개별적으로 분석하게 되면서 분석 시간이 10~30분이 소요됩니다. 모든 비타민과 관련 화합물을 10분 이내에 분석하는 CC와 이를 비교해 보세요(그림 42). 표 6에 나타낸 기존의 분석법과 달리, 능률화된 CC 분석법은 단일 컬럼, 하나의 이동상 조건, 하나의 검출기만 필요로 합니다. CC 분석에서는 용매가 종종 화합물(예: 이소옥탄, 헥산)을 추출하거나 용해하는 데 사용되는 동일한 용매를 사용하여 직접 주입되며, 일반적으로 역상 분석에 필요한 용매 교환이 필요하지 않습니다.

샘플 전처리 시간 단축

CC는 여러 기술과 분석법을 하나로 결합할 수 있어 분석물을 더 빠른 시간 내에 분리할 수 있다는 점 외에, 샘플 전처리 시간도 줄여줍니다. CC는 유기 용매와 호환되므로 다음과 같은 이점이 있습니다:

• 가수분해 및/또는 유도체화 단계 제거
• 용매 교환을 위한 증발 및 재구성 과정 제거
• 처리할 단계 수가 적어 실험 오류가 감소하고 데이터 품질 향상

예를 들어, 식품에 포함된 지용성 비타민에 필요한 여러 샘플 전처리 단계와 분석을 고려해 보세요. 식품 내 비타민 A, D, E 분석을 위한 전형적인 샘플 워크플로우를 그림 43에 나타내었습니다. 비타민 A 및 E에는 비타민 D와 비교했을 때 상이한 샘플 전처리가 필요하다는 점에 주목하세요. 또한, 각 비타민에 세 가지 HPLC 분석이 필요합니다(순상과 역상 모두). 비타민 D 분석을 위한 샘플 전처리가 특히 복잡하며, 경우에 따라서는 반분취 HPLC 단계를 포함하여 여러 단계를 수행해야 할 수 있습니다.

CC를 이용해 동일한 비타민을 분석하기 위한 샘플 전처리 절차(그림 44)는 훨씬 단순한데, 추출 프로세스 초기에 사용되는 무극성 유기 용매와 이 기술이 잘 호환되기 때문입니다. 이 예에서, 헥산 추출 중에 직접 샘플을 주입하여 비타민 E를 정량화할 수 있습니다. 그 후, 비타민 A와 D3 분석을 위해 농축시키면 기존의 분석법보다 분석 시간이 20배 빨라집니다. 또한 CC에는 세 단계의 샘플 전처리, 한 가지 분석법, 단일 기기만 필요한 반면, 그림 43에 나타난 기존 워크플로우에는 열두 단계의 샘플 전처리와 두 가지 기기 및 세 가지 분석법이 필요합니다. 표 7에 의논한 응용 분야에서 CC의 이점을 요약했으며, 이와 같은 간소화가 분석 과학자에게 이점으로 다가올 수 있는 기타 내용들도 수록했습니다.

구조적으로 유사한 화합물의 빠른 분리

이성질체와 구조적 유사체는 구조적 유사성으로 인해 분리하기가 어려운 경우가 있으며, 특히 광학 이성질체의 경우 까다롭습니다. 이제 다음과 같은 구조적으로 유사한 화합물에 CC를 이용하는 것에 대해 논의하겠습니다.

• 키랄 분리(광학 이성질체 및 부분입체 이성질체)
• 위치 이성질체(작용기의 위치에 차이가 있음)
• 구조적 유사체
  • 바이오마커(결합/비결합)
  • 약물(대사체, 불순물, 분해물)

종종 화합물의 서로 다른 광학 이성질체는 서로 다른 효능과 독성 프로파일을 나타낼 수 있으므로 연구, 개발 및 생산 단계에서 모니터링해야 합니다. 키랄 분리에는 셀룰로오스 또는 아밀로스 기반의 고정상을 이용한 이동상 LC가 주로 사용됩니다. 순상 LC에서는 그래디언트 분리를 수행하기에 어려움이 있습니다. 서로 다른 이동상 조합 및 종종 독성이 강한 용매를 사용하여 서로 다른 컬럼에서 서로 다른 등용매 분석을 수행해야 하기 때문입니다. 따라서 분석법 개발 프로세스에 상당한 시간이 소요될 수 있습니다. CC로 그래디언트를 실행하고 무독성 용매를 통해 광범위한 선택성 영역을 포괄함으로써 분석 과학자들은 단 하루만에 키랄 분리를 개발할 수 있습니다.

정제 화학자들은 수년 전부터 이러한 유형의 분리에서 SFC의 가치를 깨닫고 있습니다. 분석용 SFC 분리는 정확하게 하기는 어렵지만 빠른 키랄 선별, 키랄 분석법 개발, 광학 이성질체 과잉 측정, 키랄 반전 연구에 매우 가치가 있습니다. 순상 LC와 달리, CC는 질량분석 검출과 호환성이 매우 높아 반응 및 제조 공정 중, 그리고 생물학적 시스템에서 광학 이성질체와 그에 대한 형성을 식별하고 특성화할 수 있습니다(그림 45).

그림 46은 와파린 광학 이성질체의 분리에서 순상과 융합 크로마토그래피를 비교한 내용입니다. CC 베이스라인은 순상과 비교해 훨씬 짧은 시간에(최대 30배 더 빠름) 광학 이성질체를 분리합니다. 또한 구입 또는 폐기 비용이 많이 드는 독성 용매를 사용하지 않으므로 분석당 키랄 분리 비용이 100배 이상 절감됩니다. 이러한 모든 이점으로 인해 CC는 모든 유형의 키랄 분석에 선호되는 기술로 자리잡았습니다.

위치 이성질체 및 구조적 유사체

CC는 위치 이성질체 및 다른 구조적 유사체를 분리하는 데 유용합니다. 위치 이성질체는 분자량은 동일하지만(동중 원소) 작용기의 위치가 다른 화합물입니다. 이들은 출발 물질 분석, 반응 모니터링 및 비대칭 촉매와 관련된 응용 분야에서 종종 볼 수 있습니다. 보통, 이러한 화합물은 이성질체의 분리를 돕기 위해 GC 분석 전에 유도체화됩니다. 순상 LC 분석법은 본질적으로 견고성이 낮고 느립니다. 반면에, CC 분리의 선택성은 일반적인 조건에서 유도체화 과정 없이 위치 이성질체를 쉽게 분리합니다.

ACQUITY UPC² 시스템(그림 47)은 이성질체를 매우 빠르게 분리하므로 반응 출발 물질, 중간체 및 최종 생성물의 최적화를 실시간으로 평가할 수 있습니다. 구조적 유사체는 서로 간의 유사성 때문에 분리가 어렵고, 결합 또는 비결합(예: 글루쿠로나이드, 황산염) 바이오마커뿐만 아니라 약물 화합물의 대사물, 분해물, 불순물 등을 포함할 수 있습니다. 스테로이드는 가장 흔한 구조적 유사체 중 하나입니다(그림 48). 서로 다른 스테로이드의 구조적 유사성은 작은 질량 차이로 인해 MS 검출 사용 시에도 스테로이드를 분리하고 분석하기가 어렵습니다. CC에서는 2분 이내에 여러 컬럼에서 일반적인 선별 그래디언트를 사용하여 이들을 쉽게 분해할 수 있습니다(그림 49). 이러한 분리는 화합물의 무극성으로 인해 역상 LC 분석에서는 어려우며, GC에는 피크 모양과 검출 한계를 개선하기 위해 유도체화가 필요합니다. ACQUITY UPC² 시스템에 MS 검출을 결합하면 스테로이드를 식별하고 정량화하기 위한 적절한 솔루션이 만들어집니다.

결합 구조 유사체는 분리하기가 더욱 어렵습니다. 유리 스테로이드(그림 48)는 물에 용해되지 않기 때문에, 인체는 이를 황산화된 형태로 전환함으로써 수용성 유도체로 만듭니다. 이 프로세스의 결과로 음전하를 띤 친수성 측기가 생성되어 수용성을 갖게 됩니다(그림 50). 치료 용도로 천연 원료에서 분리된 이러한 화합물들은 질병을 연구하고 치료의 효능을 결정하기 위한 바이오마커로 활용됩니다. 이러한 화합물의 분석은 두 가지 주요 과제를 대두시킵니다.

첫째, 황산기의 효소 가수분해 후 유도체화가 필요한 30분간의 GC 분석에서는 샘플을 전처리하는 데 2.5시간이 소요됩니다. 둘째, 이러한 에스트로겐의 일부는 동중 원소(동일한 m/z)이기 때문에 질량분석법으로 이들을 분리하는 것은 불가능합니다. 따라서 서로 다른 형태의 동중 원소 화합물을 분리하기 위해 크로마토그래피가 필요합니다.

CC에서는 10가지의 황산화 에스트로겐 모두를 15분 내에 분리할 수 있는데(그림 51), 여기에는 서로 근접하게 용리되어 30분 GC 분석으로는 쉽게 분리할 수 없는 용리 피크(피크 6 및 7)도 포함됩니다(그림 52). CC 분석에서는 황산화 화합물을 본래의 형태로 분석할 수 있기 때문에 샘플을 가수분해하거나 유도체화할 필요가 없습니다. 이로 인해 치료용 제제를 분석하는 데 필요한 단계가 크게 줄어들어 처리량과 생산성이 증가합니다.

표 8에는 상기 논의한 응용 분야에서 CC 분석의 이점이 요약되어 있으며 광학 이성질체, 위치 이성질체 및 구조적 유사체를 분리하기 위한 기타 응용 분야도 나와 있습니다.

직교성

직교 분리 모드는 서로 보완적이지만 피크를 다르게 유지하는 독특한 방식이어서 단일 분리 모드보다 샘플에 대한 더 많은 정보를 생성합니다. 다양한 기술을 통해 분석물을 분리할 수 있다는 것은 다음과 같은 이유로 매우 중요합니다:

• 불순물, 분해 피크 또는 이와 유사한 화합물(예: 동중 원소 화합물 또는 동시 용리 화합물)을 식별하고 특성화할 수 있다는 확신
• 샘플의 완전한 특성화 보장
• 샘플에 대한 추가적 정보를 얻을 수 있음
• 매트릭스 간섭 물질로부터 원하는 화합물 분리

직교 분리 기법의 예로는 순상 및 역상 크로마토그래피와 같은 상호 보완적 모드가 있습니다. CC 선택성은 순상 크로마토그래피와 유사하지만, 순상 분석법보다 훨씬 견고하고 신뢰성(챕터 2 참조)과 재현성이 높습니다. 다음 섹션에는 상기 나열한 목표를 달성하기 위해 CC를 직교 분리 모드로 사용하는 방법이 소개되어 있습니다.

ACQUITY UPLC와 ACQUITY UPC² 시스템을 모두 사용하여 관련 물질로부터 활성 의약품 성분(메토클로프라미드)을 분리함으로써 이러한 직교성이 입증됩니다(그림 53). 어떤 기술로 분해되지 않는 피크가 다른 기술로는 분해되며, 그 반대도 마찬가지입니다. CC는 RPLC보다 극성 화합물을 더 오래 유지할 수 있습니다(예: 피크 1 및 2). 이 예에서 ACQUITY UPC² 시스템은 임계 쌍(피크 5 및 메토클로프라미드)을 분해하며, 따라서 후속 식별 및 특성화에서 미지 화합물을 대규모로 정제하고 분리하는 과정이 용이해집니다. 이 모두를 고려해보면 CC는 다른 일상적 기법과 병행하여 사용했을 때 다양한 분리 과제를 해결하는 데 도움을 주는 이상적 기법이라고 할 수 있습니다.

직교 분석법은 또한 생체 분석이나 식품 분석과 같이 매트릭스 간섭으로부터 원하는 분석물을 분리하는 데 중요합니다.

그림 54A는 단백질 침전을 사용하여 인간 혈장에서 추출한 클로피도그렐을 LC-MS/MS 크로마토그램으로 분석하는 전형적인 예를 보여줍니다. 클로피도그렐의 소수성으로 인해 이는 분석 중에 다소 늦게 용리됩니다. 간섭 인지질(콜린 함량 헤드기 포함)은 또한 동일한 영역에서 용리되어 잠재적으로 클로피도그렐 피크의 이온 억제와 정량화의 변동을 유발합니다(그림 54B). 흥미롭게도, ACQUITY UPC² 시스템에서 간섭 인지질은 비슷한 영역에서 용리됩니다(그림 54C). 역상 LC에 대한 CC의 직교성 덕분에 관심 분석물이 훨씬 일찍, 그리고 이러한 간섭 인지질에서 분리되어 용리됩니다(그림 54D). 이를 통해 매트릭스 효과의 가능성을 줄여 보다 정확하고 정밀한 정량화를 보장할 수 있습니다.

이러한 장점은 이 챕터 앞부분에서 언급한 CC의 세 가지 주요 특징을 보여줍니다:

1. 융합 크로마토그래피는 워크플로우를 간소화합니다.
2. 융합 크로마토그래피는 구조적 유사성을 가진 화합물을 분리합니다.
3. 융합 크로마토그래피는 역상 LC와 직교성을 갖습니다.

• 여러 기술을 하나로 결합
• 샘플 전처리 및 분석 시간 단축
• 유기 용매/추출물의 직접 주입에 사용 가능

• 광학 이성질체(키랄)
• 위치 이성질체
• 구조적 유사체 및 접합체

• 불순물/분해물 식별에 대한 신뢰도 향상
• 샘플에 대한 종합적 특성분석
• 매트릭스 간섭 불질로부터 분석물 분리