융합 크로마토그래피 입문자 가이드

이전 챕터에서 논의한 바와 같이, CC는 분리 관점에서 LC와 매우 유사합니다. 기기 측면에서도 CC는 설정점 이상으로 전체 시스템을 가압하는 추가 구성 요소인 ABPR을 제외하고 모든 면에서 LC 시스템(그림 7 참조)과 유사합니다. Waters는 CO₂ 기반 이동상의 이점을 활용하고 UPLC의 현대적인 이점을 제공하기 위해 주요 시스템 구성 요소가 CO_{2 와 같은 압축성 용매와 호환되도록 하여 저분산 내압성 ACQUITY UPLC 시스템을 변형시켰습니다.}가장 주목할 만한 점은 CC 시스템을 통한 흐름을 측정하기 위해 액화 CO₂ 펌프를 포함시켰다는 점입니다. CO₂는 먼저 액화되지만(예: 13°C에서) 압축성은 메탄올이나 아세토니트릴보다 약 3배 정도 높습니다. 따라서 재현성 있는 융합 크로마토그래피를 위해서는 펌프를 변형시켜야 했습니다.

과거 분석용 SFC 시스템의 과제

역사적으로, 분석용 SFC 시스템은 신뢰성이 낮기로 악명이 높았습니다. 이 모든 것들은 다른 목적으로 전용된 LC 시스템에 불과했습니다. LC용으로 설계된 펌프, 주입기, 검출기는 압축된 CO₂로 작동하도록 설계된 것이 아니었습니다.

단일 단계의 왕복 LC 펌프는 CO₂를 정확하고 반복적이며 안정적으로 압축하거나 전달할 수 없었습니다. CO₂만큼 압축 가능한 액체와 함께 작동하도록 설계되지 않았으며, 이로 인해 이동상 질량 유속과 질량 조성의 변화가 초래됩니다. 이는 이동상의 용매력을 변화시키며 주입 간 또는 시스템 간에 머무름 시간의 변화를 일으키기도 합니다.

또한 압축성이 높은 CO₂ 기반 이동상은 펌프와 역압 조정기에 의해 발생하는 노이즈로 인해 분석 감도가 저하됩니다. 그뿐 아니라 부분적 루프 주입을 사용할 때 정확도와 정밀도가 크게 감소하는 문제로 인해, 용도 변경된 HPLC 기기는 종종 전체 루프 주입으로 제한되어 주입 부피의 선택을 제한시킵니다. 시스템 수준에서, 용도 변경된 HPLC 시스템은 훨씬 더 큰 시스템 분산 부피를 특징으로 하므로 원치 않는 밴드 확산을 일으키고 보다 효율적인 1.7mm 입자 컬럼을 사용하지 못하게 만듭니다. 이러한 단점들은 용도 변경된 LC CO₂ 기반 시스템의 잠재적인 처리량과 달성 가능한 성능을 크게 제한합니다.

다음으로, ACQUITY UPC² 시스템의 각 개별 모듈에서 이루어진 혁신을 살펴보도록 하겠습니다(그림 7).

용매 관리 기술(펌프)

이동상 유속과 조성을 정확하고 정밀하게 제어하기 위해서는 시스템의 전체 유동 경로를 살펴봐야 합니다. 앞서 지적한 바와 같이, 지정된 용매 부피를 압축하고 동시에 정확하게 전달하도록 설계된 용도 변경된 HPLC 펌프는 액체 CO₂처럼 압축성 있는 유체를 처리할 수 없습니다. 일부 SFC 기기에서는 유입되는 CO₂가 사전 압축과 냉각을 위한 장치를 통과합니다. 이 장치는 크로마토그래피 시스템과 나란히 배치됩니다(그림 8). 이 장치가 펌프에서 멀어질수록 CO₂ 질량 유속을 정확하게 제어하기가 어려워지는데, 그 이유는 주변 온도에 따라 사전 압축과 펌핑 단계 사이에서 CO₂ 밀도가 변화할 수 있기 때문입니다. 또한, 상대적으로 압축이 잘 되지 않는 액체를 전달하도록 설계된 기존 SFC 시스템의 펌핑 알고리즘(내부 제어 소프트웨어)은 조성 정확도, 정밀도 및 머무름 시간 재현성을 유지하기가 어렵습니다. 낮은 비율의 보조 용매(co-solvent)(5% 미만)를 안정적으로 전달하려고 할 때도 동일한 문제가 발생하여 다양한 극성의 혼합물을 분석하기 어렵게 합니다.

대조적으로, Waters ACQUITY UPC² Binary Solvent Manager(BSM)는 질량 유속 및 질량 조성 조절 성능이 탁월한 완전 통합된 사전 압축 장치로 압축성 유체를 관리하도록 특별히 설계되어, 재현성과 신뢰성 있는 머무름 시간을 제공하고 베이스라인 노이즈를 무시할 수 있는 수준으로 낮춥니다. 앞서 언급한 바와 같이, 압축성 유체 시스템에서는 용매 밀도가 이동상의 용매력을 제어하기 때문에 재현성을 위해서는 정밀한 제어가 매우 중요합니다. 압축성 및 비압축성 액체 성분에 필수적인 별도의 제어 알고리즘이 낮은 비율의 보조 용매(co-solvent)(그림 9)를 포함한 다양한 이동상 조성을 정확하게 혼합하고 재현성 있는 그래디언트 프로파일(그림 10)을 제공합니다.

분석용 SFC 시스템은, 특히 그래디언트 분리의 경우, 이 정도로 정밀한 제어 수준에 도달한 적이 없었습니다. ACQUITY UPC² 시스템은 펌프 흡입, 압축 및 전달을 정밀하게 제어하도록 설계되어 초고성능 LC에서 기대되는 재현성을 제공합니다. ACQUITY UPC² BSM 내에서 사용되는 체적 밀도 제어는 질량 흐름 제어를 능가하여 탁월한 크로마토그래피 정밀도를 제공합니다. 이로 인해 용리 시간이 제어되고 용해 강도가 우수하게 제어됩니다. 펌프 헤드 자체는 독립적으로 냉각되므로 CO₂의 밀도 제어가 개선되어 정확한 질량 전달이 가능해집니다. 펌프와 통합된 압축 알고리즘은 매우 효과적이고 정확한 제어를 제공하여 액체 또는 기체 상태의 CO₂를 초기 이동상으로 사용할 수 있습니다. 그림 11은 BSM의 내부 작동을 보여줍니다. 보조 용매(co-solvent) 펌프는 UPLC 펌프이지만 CO₂ 펌프는 절연된 검정색 커버 뒤에 있습니다. 압축 및 냉각 장치는 펌프에 통합되어 있으므로, 이 절연 커버는 유입되는 CO₂의 밀도를 보다 정확하게 제어할 수 있게 해줍니다.

샘플 주입

기존의 분석용 SFC 시스템은 전체 루프 주입기나 부분 루프 주입기 사용에 관계없이 적은 양의 샘플을 재현성 있게 주입하기가 어렵습니다. 대부분의 경우 전체 루프 주입만 가능하며, 부분 루프 주입의 경우에는 주입 용매의 균질성을 유지하기 어렵습니다. 따라서 정확도, 정밀도 및 직선성이 저하되어 분석물 정량화에 어려움을 겪게 됩니다. 매번 주입할 때마다 대량의 샘플이 낭비될 수 있어 필요할 경우 샘플 루프를 수동으로 변경해야 하므로 시스템의 유연성이 제한됩니다.

ACQUITY UPC² Sample Manager는 새로운 이중 주입 밸브 설계를 채택했습니다(그림 12). 이를 통해 주요 샘플 루프가 폐기물로 배출되어 이동상의 균질성을 유지하면서 대기압 하에서 샘플이 루프에 들어갈 수 있습니다. 또한 보조 주입 밸브는 주입 시퀀스에서 발생하는 압력 펄스를 줄이고 샘플 혼입을 완화하도록 설계되어, 반복성 및 재현성 있는 부분 루프 주입을 가능하게 합니다(그림 13). 0.1μL 단위로 0.1~50μL 범위에서 주입을 할 수 있으며 이중 니들 세척 옵션을 사용하면 샘플 혼입이 무시할 수 있을 정도로 줄어듭니다. 그림 14는 1mL 단위로 1~10mL의 부분 루프 주입 시에 얻어지는 주입 직선성을 나타냅니다.

광학 검출

광학 검출은 분석용 SFC 시스템에서 때로 문제를 일으킵니다. HPLC 시스템용으로 설계된 검출기 플로우 셀은 허용할 수 없는 수준의 분산 부피와 베이스라인 노이즈를 유발할 수 있습니다. SFC에 사용되는 굴절률 검출기는 압축성 유체에서 상당한 베이스라인 노이즈와 곡률을 유발하여 펌핑 시스템에서 발생하는 노이즈를 증폭시킵니다. RPLC에서 일반적으로 사용되는 메탄올 및 물과 같은 용매는 RI 값이 매우 유사하므로(그림 15), 일반적으로 역상 분석법에서 RI 효과는 그리 크지 않습니다. CO₂는 메탄올(가장 일반적으로 사용되는 보조 용매(co-solvent))과 매우 다른 값을 가지기 때문에 LC에서보다 물질의 굴절률 범위가 커져 베이스라인 노이즈가 증가하고 감도가 제한됩니다. 더욱이 CO₂ 기반 이동상의 밀도, 따라서 굴절률은 그래디언트 분석 과정에서 변화합니다.

ACQUITY UPC² PDA 검출기는 압축성 유체에 특히 적합하게 설계되었습니다. 낮은 UV 파장에서 에너지 처리량을 감소시키는 사파이어 렌즈 대신 ACQUITY UPC² PDA 검출기의 렌즈는 분리 중에 생겨나는 역압을 견딜 수 있는 고강도 실리카로 만들어집니다. 이는 감도를 향상하고, 베이스라인 노이즈를 줄이며, CO₂와 유기 보조 용매(co-solvent) 사이의 RI 효과 차이를 보상하는 데 도움을 줍니다. 광학 벤치는 베이스라인 안정성을 더욱 개선하고 RI 효과를 완화하기 위해 열 제어됩니다. 저분산 스테인리스 스틸 플로우 셀은 좁은 피크 폭을 수용하며 10mm 경로 길이로 감도를 늘리는 동시에 탁월한 스펙트럼 성능을 유지합니다. 이렇게 실현된 탁월한 감도 덕분에 미량 수준의 불순물을 정량화할 수 있습니다(그림 16).

질량분석(MS) 검출

CC의 압축성 이동상에 맞게 광학 검출을 조정하기 위한 고유한 기기 요건과 마찬가지로, CC와 MS의 인터페이스를 위해 이동상의 압축성을 수용하도록 조정이 필요합니다. CC-MS 인터페이스는 이동상이 오늘날의 질량분석기의 이온 소스 내 가압 상태에서 대기압으로 감압될 수 있도록 해야 합니다. 이동상 압축성을 주의 깊게 고려하지 않으면 이온 소스로의 분석물 이동에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 분석물 이동이 원활하지 않으면 피크 모양 및/또는 이온화에도 문제가 생길 수 있습니다. 최악의 경우, 이온화가 일어나지 않고 질량분석기에서 원하는 분석물을 검출하지 못하게 됩니다.

압축성 이동상의 감압은 이동상 유속, 이동상 조성, 자동 역압 조정기(ABPR)에 의해 수립된 포스트 컬럼 시스템 압력과 별개로 제어되어야 합니다. 또한 감압은 이온 소스로의 효율적인 분석물 이동을 저해하지 않으면서 이루어져야 합니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 ACQUITY UPC² 질량분석기 인터페이스는 압축성 이동상에 적합하게 설계되었으며 보충 유체가 있는 분할 흐름 인터페이스로 제공됩니다. 질량분석기 인터페이스는 분배 제한장치를 통해 일반적으로 300~500μL/분(압축) 범위인 일정 유량의 이동상을 질량분석기에 도입합니다. 이동상의 나머지 부분은 넓은 범위의 이동상 유속과 조성에 걸쳐 포스트 컬럼 시스템 압력을 제어하기 위해 ABPR로 들어갑니다. ACQUITY UPC² 질량분석기 인터페이스의 개략적인 도식을 보여주는 그림 17에 분배 인터페이스와 보충 유체의 첨가가 잘 표시되어 있습니다.

CC-MS 인터페이스에서 보충 유체의 역할은 여러 가지입니다. 주로는 약 5% 변형제 하에서 전기분무 이온화(ESI) 작동에 필요합니다. ESI는 액상 이온화 기술이기 때문에 이온화를 위해서는 어느 정도의 액체가 필요합니다. 이와 같이 이동상 변형제의 비율이 매우 낮은 경우에는 이동상에 존재하는 액체의 양이 ESI에 불충분합니다. 따라서 변형제 비율이 낮은 ESI에서는 보충 유량의 형태로 액체를 첨가해야 합니다. 둘째로, 보충 유체는 분석물 이동에 도움을 줄 수 있습니다. 분배 제한장치를 따라 어느 지점에서 CO₂는 고압 고밀도 상태에서 기체 상태로 전환되어 용매력을 상실하게 됩니다. 이에 따라, CO₂가 기체로 전환된 후에는 액체 변형제만이 분석물을 용해시켜 이온 소스로 이동시킬 수 있게 됩니다. 분리 과정에 변형제가 전혀 사용되지 않거나 매우 낮은 비율로만 사용되는 경우, 이온화를 위해 분배 제한장치를 통해 분석물을 이온 소스로 이동시킬 수 있는 액체가 존재하지 않습니다. 이러한 조건에서 분석물을 이온 소스로 이동시키는 것을 돕기 위해 분배 제한장치의 상단 측에 보충 유체가 첨가됩니다. 분석물 이동이 잘 되는지 여부를 보여주는 피크의 특징적 예를 그림 18에 나타내었습니다. 이 경우 분석물 이동 불량(18A) 및 이동 양호(18B)에 대해 보충 유체 유속을 선택했습니다.

분석물이 이동상 액체 변형제에서 제한적인 용해도를 갖는 경우에도 분석물을 이동시키기 위한 보충 유체가 중요한 역할을 합니다. 때로 분석물은 액체 변형제와 압축성 이산화탄소의 혼합물에서는 용해도가 높지만 액체 변형제에서는 용해도가 낮습니다. 이러한 경우, 분석물은 CO₂가 분배 제한장치에서 기체 상태로 전환된 후 용액으로부터 침전될 수 있으며, 높은 비율의 액체 변형제가 존재하는 경우에도 마찬가지입니다. 액체 변형제에서 분석물의 용해도가 불충분하면 피크 모양이 불량해지고 인터페이스 튜브가 막히며 피크 재현성이 저하될 수 있습니다. 적절한 보충 유체를 첨가하면 새롭게 형성된 액체 변형제와 보충 유체의 혼합물에서 분석물의 용해도를 높여 이러한 어려움을 방지할 수 있습니다. 예를 들어, 높은 친유성 분석물은 CO₂/메탄올 이동상에서 용해도가 높고, 메탄올 자체에는 상대적으로 용해되지 않을 수 있습니다. 이 경우, 무극성 보충 유체를 첨가하여 액체 변형제와 보충 유체 혼합물의 순극성을 감소시킬 수 있습니다. 친유성 분석물은 저극성 액체 혼합물에 더 잘 용해되어 이온 소스로 보다 쉽게 이동할 수 있습니다.

필요한 경우, CC-MS 인터페이스의 보충 유체는 질량분석기에 이온화 강화 화합물도 도입합니다. 이러한 화합물은 분리에 영향을 주지 않고 컬럼 후방에 첨가할 수 있습니다. 5%(부피 기준) 물 및/또는 20mM 수산화 암모늄, 포름산 또는 초산 암모늄과 같은 이온화 강화 화합물로 ESI에서 이온화 효율성을 증가시킬 수 있는 경우가 많습니다. 이온화 강화 화합물의 농도와 종류는 분석물마다 매우 상이하며, 각 응용 목적에 맞게 최적의 반응을 조정해야 합니다.

보충 유체의 조성을 선택한 후에는 최적의 반응을 위해 보충 유체의 유속도 조정할 수 있습니다. MS 반응에 대해 다양한 유속을 선별할 수 있습니다. 유속이 너무 낮으면 이동이 원활하지 않을 수 있으며, 보충 유속이 너무 높으면 MS 신호가 감소되는 경우가 종종 발생합니다. 보충 유체 조성과 함께 가장 적합한 보충 유체 유량은 분석물과 분석법에 따라 다르며, 높은 신호 반응이 필요한 경우 각 새로운 용도에 맞게 조정해야 합니다. 또한, 예를 들어 ESI에서 대기압 화학 이온화(APCI)로 전환할 때와 같이 이온화 기술 사이를 전환할 때는 보충 유체의 조성과 유속을 다시 조정해야 합니다.

요약하자면, ACQUITY UPC² 질량분석기 인터페이스는 압축성 이동상에 효과적이며 ESI, APCI, ESCi 멀티 모드 이온화, 대기압 광이온화(APPI), UniSpray와 같은 대기압 이온화 기술을 사용하는 현대적 질량분석기와 인터페이스를 구성하도록 특별히 설계되었습니다.

역압 조절

압축성 용매를 다루는 시스템에서 가장 중요한 부분 중 하나는 시스템 내부의 압력을 정확하게 제어하고 유지할 수 있어야 한다는 것입니다. 지금까지 살펴본 바와 같이, 역압을 부정확하게 제어하면 이동상 밀도에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 분석물 용해화와 머무름 시간에도 악영향을 미칠 수 있습니다. 기존의 SFC 시스템은 역압을 제어하는 정확도와 정밀도가 부족한 경우가 많은데, 여기에는 역압 조정기(ABPR)에서의 압력 모니터링 불량, 반응 속도가 느린 피드백 루프, 낮은 분리능의 스테퍼 모터, 펌프에서의 압력 및 흐름 제어 불량, 시간 경과에 따른 ABPR 구성 요소의 기능 저하와 같은 다양한 원인이 있습니다.

ACQUITY UPC² 시스템은 혁신적인 이중 스테이지 활성 및 정적 BPR을 통해 역압을 효과적으로 제어합니다(그림 19). 이러한 활성 및 정적 역압 제어의 결합을 통해 정적 BPR은 시스템을 낮은 압력으로 유지하고, 활성 BPR은 사용자가 정의한 설정점을 보다 효과적으로 제어합니다(그림 20). 견고성을 향상시키기 위한 노력의 일환으로 정적 카트리지 BPR을 가열하여 ABPR 배출구에서 빠른 감압으로 인해 발생할 수 있는 이동상의 동결을 완화합니다. 이중 스테이지 BPR은 ACQUITY UPC² Convergence Manager(CM) 내에 있습니다(그림 21). 이 모듈에는 유입되는 CO₂의 인라인 미립자 필터, CO₂ 누출 검출기, 배출 밸브, 압력 조절 밸브 및 보조 주입 밸브도 있습니다.

전반적인 시스템 성능

마지막으로, ACQUITY UPC² 시스템은 ACQUITY UPLC 시스템과 마찬가지로 본질적으로 낮은 분산도를 가지고 있어 내경이 작은 컬럼과 작은 입자 크기의 컬럼을 사용할 수 있습니다(그림 22). 컬럼 내경이 좁으면 감도가 향상되고 용매가 절약되며 질량분석에 더 적합한 유속을 이용할 수 있습니다. 컬럼의 입자 크기가 작을수록 분리 효율이 높아지고 분리능이 개선됩니다.