융합 크로마토그래피 입문자 가이드

모든 크로마토그래피 분리의 기본 메커니즘은 샘플 혼합물에 있는 모든 분석물 분자가 시스템을 통해 이동하되, 분석 컬럼에서 용리될 때 검출 및 정량화에 충분할 정도로 서로 분리될 수 있도록 다른 속도로 이동하는 조건을 만드는 것입니다. 이 프로세스를 구현하기 위해 크로마토그래피에는 고정상과 이동상이라는 두 가지 주요 구성 요소가 있습니다. 고정상의 주된 역할은 화합물의 이동을 저지하거나 유지하는 것이고, 이동상의 주된 역할은 화합물이 시스템의 주입구에서 배출구까지 이동하도록 하는 것입니다. 이는 GC, LC, CC의 기본 메커니즘입니다. CC와 LC 또는 GC의 주된 차이점은 이동상의 특성이 각 크로마토그래피의 거동에 영향을 미치는 방식입니다.

LC 및 GC와 비교하여 CC에서 이동상의 역할

GC에서 이동상은 일반적으로 불활성 또는 비반응성 기체(일반적으로 He 또는 N₂)입니다. GC 작동 온도와 압력에서 이동상은 분석물 분자를 용해시키거나 고정상 표면을 변형할 수 없습니다. GC 이동상은 주로 GC 컬럼을 통해 분석물 분자를 운반하거나 구동하는 역할을 합니다. 분석물의 머무름과 분리는 분석물 분자와 고정상 간의 상호작용을 통해서만 이루어집니다. 이는 분석물 분자와 고정상 간의 상호작용을 통해서만 이루어집니다. 이 내용이 그림 3에 분석물 분자 주위의 빈 공간으로 개략적으로 설명되어 있습니다.

반면 LC에서 이동상은 능동적 역할을 하여, 해당 분자가 분석물 분자 및 고정상 모두와 강하게 상호작용합니다. 이동상은 분석물을 직접 용해시킬 뿐만 아니라 분석물과 고정상 상호작용(고정상 표면을 놓고 경합)에 영향을 미치는 식으로 분석물 머무름에 영향을 줍니다(그림 3). 

그림 3은 LC에서의 RPLC 모드와 NPLC 모드를 나타냅니다. 이러한 두 가지 LC 모드 간의 주된 차이 중 하나는 이동상의 조성입니다. 즉, RPLC는 수성 기반이고 NPLC는 유기성 기반입니다. RPLC에서 수성 기반의 이동상은 C₁₈ 고정상과 결합하여 분석물이 고정상과 갖는 상호작용을 효과적으로 변형시키므로, 다양한 화합물 혼합물로부터 샘플 분석물을 분리하는 데 중요한 역할을 하게 됩니다. RPLC 분석법 개발에서, 첫 번째 변형은 주로 고정상이 아닌 이동상에 대해 이루어집니다. 이에 비해 NPLC에서는 헥산 또는 헵탄 기반의 이동상이 상대적으로 완화의 역할을 하며, 분리가 주로 고정상 케미스트리를 변화시킴으로써 이루어집니다.

CC에서 이동상의 역할은 초임계와 관계없이 CO₂의 고유한 특성으로 인해 RPLC와 NPLC 간의 중간에 위치해 있습니다. 압축된 CO₂는 헵탄이나 헥산 등과 마찬가지로 무극성입니다. 이렇게 보면 CC는 NPLC에 가깝습니다. 그러나 한 가지 중요한 차이점은 CO₂가 극성 보조 용매(co-solvent)(예: 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴)와 완전히 혼합될 수 있기 때문에 거의 항상 등용매 모드에서 사용되는 NPLC와 달리 그래디언트 모드에서 사용될 수 있다는 것입니다. 또한 CC 이동상은 분석물 용리에 강력한 역할을 할 수 있는 소량의 물에 NPLC보다 훨씬 더 내성이 있습니다.

다음 섹션에서는 주요 용매 간의 특성 차이를 바탕으로 RPLC와 NPLC를 CC와 체계적으로 비교해 보겠습니다.

크로마토그래피 거동에 영향을 미치는 CO2 특성의 역할

다른 용매와의 CO2 혼화성

CO₂는 헵탄(=0.1)과 유사한 극성 지수를 갖는 무극성 용매입니다. 그러나 헵탄과 달리 CO₂는 0이 아닌 quadruple 모멘트(-13·4 ± 0·4 × 10^–40 C m²)를 가지며, 높은 극성의 유기 용매(예: 아세토니트릴(극성 지수 = 5.8) 및 메탄올(극성 지수 = 5.1))와 완전히 혼화됩니다. 이는 물(극성 지수 = 10.2)과 거의 혼화되지 않지만, 상당한 비율의 물이 포함된 메탄올/물, 이소프로판올/물 또는 아세토니트릴/물 혼합물과 혼화됩니다. 이러한 광범위한 혼화성 덕분에 CC 이동상이 NPLC 및 RPLC 이동상보다 보다 넓은 범위에 걸쳐 극성을 확장할 수 있습니다. 표 1은 RPLC, NPLC, CC에 사용되는 용매의 용리(용리 강도) 값과 극성 지수 측면에서 상황을 간략하게 나타낸 것입니다.

표 1에서 RPLC의 수성 기반 이동상은 대부분의 다른 유기 용매와 물의 제한적 혼화성으로 인해 제한된 범위의 용리 서열만 이용할 수 있다는 점에 주목하기 바랍니다. NPLC의 경우에도 마찬가지로, 헥산/헵탄 기반 이동상은 극성이 높은 용매와 무극성 유기물의 제한적 혼화성으로 인해 넓은 용리 범위를 허용하지 않습니다. NPLC의 또 다른 문제는 일부 유기 용매들이 서로 간에도 잘 혼화되지 않아 특정 혼합물에서 호환성이 없다는 것입니다. 반면, CC의 경우 압축된 CO₂는 전체 용리 서열에 걸쳐 다른 모든 용매와 혼화될 수 있으므로, 분리의 선택성에 영향을 미칠 광범위한 이동상 선택이 가능합니다(표 1 참조). CO₂는 무극성이지만, CC는 특히 높은 극성 쪽에서 RPLC에 비해 훨씬 넓은 용리 세기를 가질 수 있기 때문에 RPLC와 대등합니다. 예를 들어, CO₂와 메탄올을 결합하면 이동상 용리 세기를 0~0.73E^o 범위에서 프로그래밍할 수 있습니다.

확장된 용리 범위와 함께, CC의 CO₂ 기반 이동상은 매우 폭넓은 고정상 케미스트리와 호환됩니다. 표 2는 NPLC와 RPLC에 일반적으로 사용되는 고정상 목록입니다. 대부분의 RPLC 분리에는 C₁₈ 고정상이 사용되며 다른 결합상을 사용하는 경우는 비교적 적습니다. 나열된 고정상 중 일부는 극성이 높기 때문에 RPLC에서 전혀 사용할 수 없습니다. NPLC와 마찬가지로, 컬럼 선택은 이동상의 극성 범위에 의해 제한됩니다. CC를 사용하면 극성 범위가 넓어지기 때문에 이러한 모든 컬럼 케미스트리를 선택할 수 있습니다. 즉, 선택성의 폭이 넓어집니다(그림 4 참조). West와 Lesellier가 지적한 바와 같이, 이러한 모든 케미스트리는 동일한 이동상 조성으로 작동할 수 있기 때문에 매우 상이한 극성을 가진 컬럼을 결합할 수 있는 흥미로운 가능성이 열립니다.

CO₂ 혼화성이 중요한 또 다른 이유는 CC가 광범위한 샘플 희석액(샘플이 용해되거나 희석된 용매)과 호환된다는 것입니다. CC의 이러한 측면은 실험실의 전체 워크플로우에 큰 영향을 미칩니다. 크로마토그래피 실험실에서 가장 큰 병목을 일으키는 부분은 샘플 전처리인 경우가 많습니다. 대부분의 일반적인 샘플 전처리 방법은 표적 분석물이 현재 LC 시스템과 호환되지 않는 용매에 용해되는 결과를 초래합니다. 예를 들어, 많은 분석물들은 유기 용매에 쉽게 용해되며, 따라서 이를 통해 가장 잘 추출됩니다. 많은 양의 유기 용매가 RPLC와 호환되지 않으므로, 유기 용액 또는 추출물을 RPLC와 호환되는 상태로 변환하기 위해 추가적인 단계가 필요한 경우가 많습니다(그림 5). CC는 유기 용매에 용해된 샘플의 직접 주입으로 작동할 수 있으므로 유기 용매의 증발 단계 및 역상 분리에 필요한 수성 기반 희석액으로의 샘플 재구성(시간이 많이 소요됨)이 더 이상 필요하지 않게 됩니다. 따라서 전반적인 분석 과정에서 상당한 비용이 절감됩니다. 또한 분석 시간을 훨씬 많이 단축할 수 있으며, 특히 다수의 샘플을 분석하도록 설정된 여러 RPLC 시스템을 실행하는 실험실의 경우 합산된 효과가 클 수 있습니다.

간단히 말해, 무극성 압축 CO₂를 용리 스펙트럼의 양끝에서 보조 용매(co-solvent)와 결합하고 다양한 고정상이 CC와 호환된다는 사실을 함께 고려하면 대단히 넓은 선택성 범위를 탐구하여 CC를 다양한 분리 과정에 적용할 수 있습니다.

CO2 전달 특성

CC의 또 다른 특징적 이점은 낮은 점도로, 이로 인해 CC 이동상에서 분석물 분자가 높은 확산도를 갖게 됩니다. 물리적 특성 관점에서 크로마토그래피 컬럼의 효율성은 이동상에서 분석물의 확산도에 의해 좌우됩니다. 분자의 확산도가 높을수록 고정상 입자 공극을 빠르게 드나들 수 있어 이동상이 빠르게 흐르는 경우에도 높은 효율성을 얻을 수 있습니다. CC에서는 상당한 양의 액체 변형제(예: CO₂/메탄올(70/30, mol/mol%))를 첨가한 후에도 이동상 점도가 LC 이동상 점도의 절반 이상입니다(표 3 참조). 이는 컬럼 효율성을 떨어트리지 않으면서 CC를 훨씬 더 높은 이동상 유속으로 작동할 수 있다는 것을 의미합니다. 따라서 CC는 고처리량 분석에 적합한 기술입니다.

빠른 키랄 선별 및 아키랄 분리를 위한 순상 크로마토그래피 대안이라는 두 가지 핵심 응용 영역에서 CC의 이점이 큽니다. 키랄 선별의 경우 분석 시간이 20분에서 3분으로, 7배 단축되고 분리능도 증가합니다. 이러한 개선은 주로 CC에서 용매 그래디언트를 사용했기 때문에 얻어진 결과이며, NPLC에서는 불가능합니다. CC의 또 다른 부수적 이점은 용매 소비량이 적어 비용이 상당히 절감된다는 것입니다.

순상 유기 용매를 주로 압축된 CO₂로 구성된 이동상으로 교체하면(그림 6) 분석당 비용이 샘플당 약 6달러에서 5센트로 절감됩니다. 분석 시간 단축, 용매 구입 비용 및 폐기 비용 절감에 따른 전반적인 재정적 효과는 매우 큽니다.

기타 이로운 특성의 역할

표 4는 LC 이동상과 비교한 CC 이동상의 이점을 보여줍니다. 혼화성과 낮은 점도의 이점 외에, 표면 장력이 낮다는 이점 또한 있습니다. 낮은 표면 장력은 이동상이 고정상 입자의 공극으로 더 빨리 들어갈 수 있게 하여 컬럼의 평형 도달 속도를 높입니다.

CC를 매우 매력적인 크로마토그래피 시스템으로 만들어주는 CO₂의 다른 특성으로 보다 저렴하고 사용하기가 안전하며 지속 가능하다는 점 등이 있습니다. CO₂는 쉽게 구할 수 있으며 기타 중요 프로세스(예: 석유화학 산업의 부산물로서 아세토니트릴의 경우와 같이)의 영향을 받지 않습니다. 상용 등급의 CO₂는 탄소 중립적이며 친환경 용매로 간주됩니다. CO₂는 다른 유기 용매에 비해 훨씬 저렴하며, CO₂는 폐기 비용 없이 대기로 직접 배출(재활용되지 않을 경우)할 수 있습니다.

CO₂는 불연성이고 독성이 없고 저장이 용이합니다. CO₂의 특성인 혼화성과 낮은 점도 특성을 함께 가지고 있고, CC를 많은 응용 분야에서 LC보다 우수한 기술로 만들어주는 CO₂의 경제성 및 친환경성을 갖춘 이동상을 찾기는 불가능합니다. 표 4에 나열된 이러한 모든 특성들을 하나로 가지고 있는 CO₂는 대단히 독보적인 용매라고 할 수 있습니다.

초임계인가 아닌가?

앞에서 설명한 바와 같이, 크로마토그래피의 관점에서 이동상이 초임계인지 아닌지는 CC에서 중요하지 않습니다. 단, 크로마토그래피 분리를 수행하기 위해서는 CC 이동상이 기체와 액체의 불균일 혼합물이 아닌, 반드시 균일 혼합물이어야 한다는 조건이 따릅니다. 균질함을 보장하기 위해 CC의 이동상은 특정 압력 이상으로 유지되며, 이는 자동 역압 조정기(ABPR)를 통해 쉽게 설정할 수 있습니다.