UPLC の入門ガイド

性能向上の結果

システム圧力への対処

前のセクションで、小さいクロマトグラフィー粒子およびシステムのバンドの広がりの最小化（装置とカラムの両方）のメリットを説明しました。UPLC テクノロジーにより、システムのバンドの広がりを最小化することによってクロマトグラフィー性能の向上が促進され、効率的な分離がより短時間で行えるようになり、データの質が改善します。しかし、バンドの広がりのみが、小さい粒子で得られる性能を決定する唯一の要因ではありません。使用可能な装置の圧力も大きな役割を演じます。

圧力は、移動相が、ポンプからインジェクターへ、インジェクターからカラムへの接続チューブへ、カラム自体、カラム後のチューブ、検出器セルを通過するときに必然的に生じます。システム圧力の大きさは、これらすべての構成要素（装置およびカラム）の累積効果です。流量を増加させると、接続チューブ自体を通って流れる移動相によって生じる圧力が増加します。さらに、チューブの ID および長さも、流量との組み合わせで、生じる圧力の大きさに影響します。2 本のカラムの間の圧力差は、装置自体によって生じる圧力を合計システム圧力（装置 + カラム）から減算することで、理論的予測に対して比較できます。

粒子径が小さくなると、粒子径の二乗に反比例して背圧が増加します。同時に、粒子径が小さくなると、最適の移動相の速度（線速度）が増加します。したがって、特定の粒子径に対する最適な線速度での圧力は、粒子径の三乗に反比例して増加します（図 44）。

図 44：一定のカラム長での最適圧力（∆Popt）と粒子径（dp）の関係。粒子径が 3 分の 1 に減少すると、圧力は 27 倍に増加します。

このことは、小さい粒子のカラムを従来の HPLC 装置で利用してクロマトグラフィー分解能を改善しようとする場合（カラム長を一定に保って粒子径を小さくする）や分離能を維持（L/d_p 比一定）しつつ分析速度を改善しようとする場合の重要な制限になります。従来の HPLC 装置の圧力制限（350 ～ 400 bar、5000 ～ 6000 psi）により、多くの場合、小さい粒子を使用すると、カラム長や準最適線速度（流量）が制限されます。

カラム長が一定の場合、粒子径を 5.0 µm から 1.7 µm に減らすと（粒子径が 1/3 に減少）、背圧が 27 倍に増加することが理論的に予測されます。ほぼ理論予測通りに、5.0 µm カラムから同じ長さの 1.7 µm カラムに移行したときにシステム圧力が 22 倍に増加しました。図 45 からわかるように、1.7 µm カラムは、従来の HPLC 装置の上限圧力を上回る圧力で良好に動作しています。

粒子径を小さくすることにより見られる背圧の大きな増加は、粒子径 2 µm 以下のカラム（および対応する LC 装置）が、ACQUITY UPLC システムが登場するまで商業的に成功しなかった主な理由の一つです。

図 45：粒子径および最適流量がカラム圧力（合計システム圧力から減算）に及ぼす影響。カラム長が一定。2.1 × 50 mm カラム、流量 = 0.6 mL/分（1.7 µm）および 0.2 mL/分（5 µm）。

分離の目標が、分離能を維持しつつ分析時間を短縮する（L/d_p 比を一定に保つ）ことである場合、圧力の増加は、カラム長を一定に保って粒子径を小さくする場合よりはるかに小さくなります。圧力の変化は、粒子径の二乗（粒子径の三乗ではなく）に反比例します（カラム長が比例して短くなるため）。

図 46.異なるカラム長での最適圧力（∆Popt）と粒子径（dp）の関係。粒子径とカラム長が 1/3 に減少すると、圧力は 9 倍に増加します）。

この例では、カラム長と粒子径の両方が 1/3 に減少します（図 47）。つまり、背圧は 9 倍増加すると予測されます。観測値は、理論予測とよく一致しています。L/d_p を一定に保って、5.0 µm で長さ 150 mm のカラムから 1.7 µm で長さ 50 mm のカラムにすると、11 倍の背圧増加が見られます。

図　47：粒子径、カラム長、最適流量がカラム圧力（合計システム圧力から減算）に及ぼす影響。L/dp 比は一定。分析時間に大きな差があることに注目してください（UPLC 分離が 7 倍

最適流量で実行するとき、小さい粒子によって生じる圧力は、従来の HPLC システムの圧力限界を超えています。ACQUITY UPLC システム（上限圧力 1030 bar（15,000 psi））はこれらの圧力に対応するように設計されており、粒子径 2 µm 以下の粒子をその最適流量で正常に実行できます。

高温

小さい粒子によって生じる高い圧力を補償する 1 つのアプローチは、カラム温度を上げることです。カラム温度を上げると、移動相の粘度が低下し、結果として背圧が低下します（流量を一定に保つ場合）。ただし、分析種分子が固定相に出入りする（拡散）速度も増加し、性能を維持するためには流量を増加させることが必要になります。

カラム温度を 30 ℃ から 90 ℃ に上げると、効率を維持するには流量を増加させる必要があります（図 48）。クロマトグラフ理論に合致するいずれの温度で最高理論段数を比較しても、効率の向上は見られません。

図 48：カラム温度が効率に及ぼす影響。ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 × 100 mm、1.7 µm カラムでアイソクラティック条件を使用して得られたアミルベンゼンに対する保持。

理論段数をシステム圧力に対してプロットすると、より興味深い比較ができます（図 49）。データをこのようにプロットすることにより、最大のカラム効率は、分離の際の温度とは無関係に、ほぼ同じシステム圧力で得られることが明らかになります。つまり、小さい粒子の使用に関連する圧力を回避するために高温を使用することはできません。言い換えると、従来の HPLC 装置は、非常に小さい粒子の効率的な使用には適していません。