UPLC の入門ガイド

サンプル混合溶液は、サンプルバイアルから移動している流体流（移動相）に移されます。次にサンプルは、高圧ポンプにより移動している移動相とともに、クロマトグラフィーカラムのヘッドに運ばれます。移動相と注入されたサンプル混合溶液は、カラムに入り、粒子ベッドを通過して出てきた分離された混合液が検出器（図 3）に移ります。

まずサンプルバンドがどのようにして個々の分析種のバンドに分離するかを考えましょう（送液の方向を緑色の矢印で示しています）。図 4A はタイムゼロ（注入の瞬間）のカラムで、このときサンプルがカラムに入り、バンドを形成し始めます。ここに示されているサンプルは、黄色、赤色、青色の色素の混合液であり、カラムのインレットで単一の黒色のバンドとして現れています。

数分後に、移動相が連続して途切れずに充塡剤粒子を通過する間に、個々の色素が異なる速度で別々のバンドで移動するのがわかります（図 4B）。これは、移動相と固定相の間にそれぞれの色素または分析種を引き寄せる上で競合があるためです。黄色の色素のバンドが最も速く移動し、カラムからちょうど出るところです。黄色の色素の方が、他の色素よりもこの移動相に引き寄せられています（好んでいる）。したがって、この色素は、移動速度が速く、移動相に近い速度になっています。青色の色素のバンドは、移動相よりも充塡剤に引き寄せられています。粒子により強く引き付けられるため、移動が大幅に遅くなります。つまり、この色素は、このサンプル混合物中で最もよく保持されている化合物です。赤色の色素のバンドは、移動相に対して中等度の親和性を示すので、カラムの中を中等度の速度で移動します。各色素のバンドが異なる速度で移動するため、混合物をクロマトグラフィー分離することができます。

クロマトグラフィーバンドがどのようにしてピークになるか

それぞれの特定の分析種のバンドは、多くの分析種分子で構成されています。バンドの中心には最も高濃度の分析種分子が含まれ、バンドの先端および終端では、徐々に濃度が減少して移動相との接点になります（図 5）。

分離された色素のバンドがカラムを離れると、すぐに検出器に入ります。検出器は、それぞれの分離された化合物のバンドを、移動相のバックグラウンドに対して識別（検出）します（図 6 を参照）。適切な検出器（UV、ELS、蛍光、質量検出器など）には、化合物の存在を検知する能力があり、対応する電気的シグナルがコンピューターのデータステーションに送られ、そこでピークとして記録されます。検出器はバンド内のさまざまな濃度の特定の分析種分子に応答し、そこでバンドの中心（分析種分子が最も密集している）がピークの頂点として検出器によって判定されます。

クロマトグラムとは？

クロマトグラムとは、HPLC システムで化学的に（クロマトグラフィーにより）行われた分離を表すものです。ベースラインから立ち上がる一連のピークが時間軸に対して描画されます。各ピークは、異なる化合物に対する検出器レスポンスを表します。クロマトグラムは、コンピューターのデータステーションによってプロットされます（図 6 を参照）。黄色のバンドは検出器のフローセルを完全に通過しており、生成した電気的シグナルがコンピューターのデータステーションに送られています。得られるクロマトグラムが画面に現われ始めています。サンプルが初めて注入されたときにクロマトグラムの作成が開始され、画面の下部付近に描かれる直線として始まることに着目してください。これはベースラインと呼ばれ、時間の経過とともにフローセルを通過する純粋な移動相に対応します。黄色の分析種のバンドがフローセルを通過すると、シグナル（分析種分子の濃度によって変わる）がコンピューターに送られます。この線は、サンプルのバンド内の黄色色素の濃度に比例して、最初に上向きにカーブし、次に下向きにカーブします。これにより、クロマトグラムのピークが作成されます。黄色のバンドが検出器のセルから完全に出たら、シグナルのレベルはベースラインに戻り、フローセルには、再び純粋な移動相のみが含まれるようになります。黄色のバンドは最も速く移動し、カラムから最初に溶出するため、これが最初に描画されるピークとなります。しばらくすると、赤色のバンドがフローセルに到達します。赤色のバンドがセルに入るとシグナルがベースラインから立ち上がり、赤色のバンドに対応するピークが描画されます。この図では、赤色のバンドはフローセルを完全には通過していません。この図は、この時点でプロセスを止める場合に、赤色のバンド/ピークがどのように見えるかがわかります。赤色のバンドのほとんどがすでにセルを通過しているため、実線で示されているように、ピークのほとんどが描画されています。このクロマトグラフィーのプロセスを続行すると、赤色のバンドはフローセルを完全に通過し、赤いピークの描画が完了します（点線）。最も強く保持されている青色のバンドが最も遅い速度で移動し、赤色のバンドの後に溶出します。点線は、分析を最後まで継続した場合に、完了したクロマトグラムがどのように見えるかを示しています。興味深いことに、カラム上では青色の分析種のバンドの幅が最も狭いのに、カラムから溶出する時には最も広くなっています。これは、青色のバンドがクロマトグラフィー充塡剤のベッド内を移動する速度が遅く、完全に溶出するのにより多くの時間（および移動相容量）を要するためです。移動相は一定流量で連続的に流れているため、青色のバンドが広くなり、より希釈されます。検出器はバンドの濃度に比例して応答するため、青色のピークは高さが低く、幅が広くなります。

バンドの広がり

サンプル/分析種は、検出器に到達する前に、クロマトグラフィーシステムの複数のコンポーネントを通過します。これが、クロマトグラフィーバンドのゆがみや広がりの原因になります（図 7）。この現象はバンドの広がりと呼ばれます。分析種のバンドが広くなるにつれて、得られるクロマトグラムのピーク幅が大きくなります。バンドが広いと希釈効果が生じ、ピーク高さが減少するとともに感度および分離能が低下します。逆に、バンドの広がりが最小限に抑えられると、狭いクロマトグラムバンドが得られ、効率が高くなります。これらのより高く、より狭いクロマトグラフィーピークは、検出器による検出が容易であり、分析種バンドがより濃縮されているため、感度および分離能が高くなります。したがって、バンドの広がりに影響する要因に注意することが、これらの影響を低減し、制御して、クロマトグラフィー性能を全体的に向上させる上で重要です。

クロマトグラフィーシステム内では、カラムおよびカラム外（カラム以外のすべて）の影響がバンドの広がりの原因になります。カラム外のソースには、注入量、サンプルインジェクターとカラムの間の装置の流路、カラムの出口から検出器までの流路（フローセルを含む）、およびそこに含まれるすべての接続部が含まれます。バンドの広がりのカラムのソースには、充塡剤の粒子径、カラム内の充塡の適切さ、および移動相の速度や分析種のサイズと形状との関連でその拡散特性などがあります。これらの寄与因子それぞれの分散(σ2)の和がピーク幅に影響します（図 8）。

液体クロマトグラフィーの性能を大幅に向上させるには、カラム外およびカラムのバンドの広がりの影響を低減する必要があります。ACQUITY UPLC システムは、両方の形のバンドの広がりを低減することにより、効率および感度の向上を得るという概念に基づいています（図 9）。

カラム外（装置）のバンドの広がりへの対処

クロマトグラフィー性能の大幅な向上を実現するため、かなりのエンジニアリングの取組みが行われ、小粒子（2 µm 以下）充塡による圧力に対応できると同時に、分離カラムの理論的性能を達成できるように流路での拡散を最小化するべく LC 装置が設計されました。同等に重要なことは、装置がラボでのルーチンの使用に対して高信頼度で、堅牢で、精密な分析ツールであることです。装置の設計の重要性を実証するには、システムの拡散（装置 + カラムのバンドの広がり）がクロマトグラフィーの結果にどのように影響するかを理解する必要があります。

理論段数（N）（または効率）の測定では、ピークの拡散を考慮します。ピーク幅は、分析種が検出器を通過するときの分析種のバンドの広さに直接関連し、ピークの頂点は、そのバンドの中で分析種分子の濃度が最大になるポイントです。この測定は、アイソクラティック条件で行います。

理論段数の式は図 10 に示すように導出できます。ここで、（Vn）はピークの溶出量、（w）はピーク幅、（a）はピーク幅を測定する位置でのピーク高さに基づいて決まる定数です。ピークが完全に対称であるかぎり、ピーク幅を測定するどの方法でも同様の理論段数の結果が得られます。ピークにフロンティングやテーリングがある場合、測定法によって異なる結果が得られます。

理論段数はカラム自体の性能のみを指すというのはよくある誤解ですが、カラムと装置の両方に起因するバンドの広がりは、理論段数を決定する元となるピーク幅にも影響します。バンドの広がりに対する装置自体の影響を実証するため、単一の HPLC カラムを 2 種類の装置（標準 HPLC（バンドの広がり = 7.2 µL）および ACQUITY UPLC システム（バンドの広がり = 2.8 µL））で実行しました。同じカラムを両方のシステムで実行するため、バンドの広がりに対するカラムの寄与の影響は一定に保たれます。ACQUITY UPLC システムでは効率の向上が見られることから、バンドの広がりが小さい装置では狭いピーク幅が得られ、理論段数が大きくなることがわかります（図 11）。

チューブの長さおよび直径の影響

サンプルのバンドが流路の流れに導入された後、カラムに移動します。ACQUITY UPLC サンプルマネージャーは、バンドの広がりを最小限に抑えるため、インジェクターとカラムインレットの間の距離が最小になるように設計されています。カラムにより、サンプルのバンドが個々の分析種のバンドに分離されます。その後、クロマトグラフィー分離された分析種のバンドは、カラムから検出器に移されます。一見したところでは、カラムアウトレットと検出器インレットを接続しているチューブの内径（ID）は重要でないと考えるかもしれません。しかし、内径が装置でのバンドの広がりに大きな影響を与えることがあります（図 12）。

予想されるように、バンドの広がりはチューブの ID の低減につれて低減します。濃縮された分析種のバンドを大きな ID のチューブに流すと、バンドが薄まり、幅の広いひずんだピークになり、感度が低下します。さらに、チューブの壁に沿った摩擦により、チューブの壁に接触している分析種分子の移動がチューブの中心にある分子より遅くなり、バンドのプロファイルがひずみます。分析種のバンドの中心と外端の間の距離は、チューブの ID が減少するにしたがって短くなります。これにより、バンドでのひずみの程度が減少します。チューブの長さを最小化することも同等に重要です。過剰な長さもサンプルバンドをひずませることがあるためです。

検出器の設定がカラム外のバンドの広がりに及ぼす影響

装置の流体ベースのバンドの広がりの寄与に加えて、取り込み速度に関連するデジタル検出器の設定およびフィルター定数もクロマトグラフィーの結果に影響します。これは特に UPLC アプリケーションの場合に重要です。ピーク幅が非常に狭く（1 ～ 2 秒）、分析時間が非常に短い場合が多いためです。検出器の取り込み速度を設定する際、その選択は、ピーク全体にわたって十分なデータポイントを取り込んでピークに反映できることに基づいている必要があります。検出速度を高く設定しすぎると、シグナル対ノイズ比が悪影響を受け、対象の分析種のシグナルの高さが増加せずに、ベースラインノイズが増加します。逆に、検出器の取り込み速度を遅く設定しすぎると、ピーク全体にわたるデータポイントが不足し、クロマトグラフィー効率が低下して、再現性のある定量を実行する能力が損なわれます。さらに、タイムコンスタント（デジタルフィルター）を用いて、取り込み速度と共に、またはこれとは独立に、データポイントをスムージングしてシグナル対ノイズを最適化することができます。

分析種のバンドの幅が狭くなるにつれて、検出器の設定がますます重要になります。したがって、取り込み速度は、デジタルのピークが作成されるのに十分な速度であるだけでなく、近接して溶出するピークが存在する場合に、UPLC カラムで高分離能での分離が得られる速度である必要があります。

これらの設定により、流量が遅くピークが時間軸上で拡散している場合に、それが許容されます。一方、ピークがより狭くなり、分析がより迅速になるにしたがって（UPLC 分離のように）、取り込み速度およびタイムコンスタントの設定を慎重に維持する必要があります（図 13）。「リアルタイム」のアプリケーションに UPLC テクノロジーを使用する場合、最も狭いピークのピーク形状を正確にキャプチャーできる検出器のデータ取り込み速度（Hz）を選択し、分析に最適なシグナル対ノイズ比および分離能が得られるフィルタータイムコンスタント（秒）を適用するのが賢明な選択です。