液体クロマトグラフィーの入門ガイド

図 H では、3 種類の色素化合物がクロマトグラムで時間で分離された 3 つのピークとして示されています。各溶出液は特定の位置に溶出し、注入時点（時間 0）とピーク最大量が溶出する時点の間の経過時間が測定されます。各ピークの保持時間（t_R）を、同じクロマトグラフィーシステム（同じ移動相と固定相を使用）に注入したレファレンス標準試料と比較することで、各化合物を同定できる場合があります。

図 I-1 に示すクロマトグラムから、これらの LC システム条件で、分析種（アクリルアミド）が分離されてカラムから 2.85 分（保持時間）に溶出することがわかります。同じ条件下で新しいサンプル（たまたまアクリルアミドが含まれている）が LC システムに注入された場合、ピークが 2.85 分に存在します（図 I-2 のサンプル B を参照）。

（なぜ一部の化合物が他の化合物よりもゆっくり移動する（より長く保持される）かについてより理解を深めるには、HPLC 分離モードを参照してください）。

同定されたら、次の重要な情報は、サンプルに含まれている各化合物の量です。検出器から得られるクロマトグラムと関連するデータは、それぞれの化合物の濃度を計算するのに役立ちます。検出器は基本的に、フローセルを通り抜ける化合物のバンドの濃度に応答します。濃度が高いほど、シグナルは強くなります。これは、ベースライン上に、より大きなピークの高さとして現れます。

図 I-2 に、サンプル A と B のクロマトグラムを、同じタイムスケールで重ねたものが示されています。両方の分析で、同じ量のサンプルを注入しました。どちらのクロマトグラムにも保持時間（t_R）2.85 分にピークが現れており、各サンプルにアクリルアミドが含まれていることが示されています。しかし、サンプル A に表示されたアクリルアミドのピークははるかに大きいピークです。ピーク下の面積（ピーク面積カウント）は、測定された化合物の濃度を表します。この面積値は、コンピューターデータステーションによって自動的に波形解析して計算されます。この例では、サンプル A のアクリルアミドのピーク面積はサンプル B のこの面積の 10 倍です。レファレンス標準試料を使用することにより、サンプル A に 10 ピコグラムのアクリルアミドが含まれていると定量でき、これはサンプル B 中の量（1 ピコグラム）の 10 倍です。両方のサンプルで 1.8 分に溶出する別のピーク（未同定）があることに注意してください。両方のサンプルに見られるこのピークの面積カウントがほぼ同じであるため、この未知化合物の濃度は両方のサンプルで同じである可能性があります。

アイソクラティック LC システムおよびグラジエント LC システムの操作

HPLC では、2 つの基本的な溶出モードが使用されます。1 つはアイソクラティック溶出と呼ばれます。このモードでは、移動相（単一溶媒または混合溶媒）は、分析の間に同じままに維持されます。一般的なシステムを図 J-1 に概説します。

もう 1 つのモードはグラジエント溶出と呼ばれ、その名前に示されているように、移動相組成が分離の間に変わります。このモードは、極性が広範囲にわたる化合物を含むサンプルに有用です（「HPLC 分離モード」セクションを参照）。分離が進むにつれて、移動相の溶出力が増し、より強く保持されているサンプル成分が溶出します。

図 J-2 に示されているのは、溶媒ボトル 2 本とポンプ 2 台を備えた最もシンプルなケースです。各ポンプの速度はグラジエントコントローラーによって管理され、分離の過程にわたっておよその量の各溶媒が送液されます。2 つの流れがミキサーで混合され、カラムに送液される実際の移動相組成が徐々に作成されます。最初は、移動相には高い割合の弱溶媒（溶媒 A）が含まれます。時間の経過とともに、より強い溶媒（溶媒 B）の割合が、あらかじめ決められたタイムテーブルに従って増加します。図 J-2 でわかるように、ミキサーがポンプの下流にあるため、グラジエントは高圧下で作成されることに注意してください。他の HPLC システムでは、単一のポンプの前で、溶媒の複数の流れを低圧下で混合するように、設計されています。グラジエントプロポーショニングバルブ、4 つの溶媒ボトルから溶媒を選択し、移動相の強度が経時的に変わります（図 J-3 を参照）。

HPLC スケール（分析、分取、解析）

これまでに、サンプル中に存在する化合物の同定と定量の両方に使用できる分析データが、HPLC によってどのように得られるかについて説明しました。しかしながら、HPLC を使用して、検出器フローセルの下流にあるフラクションコレクターを用いて、必要な量の各化合物を精製および収集することもできます。このプロセスは、分取クロマトグラフィーと呼ばれます（図 K を参照）。

分取クロマトグラフィーでは、カラムから溶出する個々の分析種を収集できます（この例では黄色、赤色、そして青色）。

フラクションコレクターにより、指定された時間の間、精製された分析種が含まれている溶離液が選択的に収集されます。各容器は、それぞれに単一の分析種ピークのみが収集されるよう移動されます。

研究者は、純度のレベルと量の目標を決定します。サンプルの複雑さ、および対象分析種のそのマトリックス成分との相対的な性質と濃度に関する知識と組み合わせて、これらの目標によって処理する必要があるサンプルの量および HPLC システムの必要キャパシティーを決定します。一般に、サンプルサイズが大きくなると、HPLC カラムのサイズが大きくなり、ポンプにはより高容量流量キャパシティーが必要になります。HPLC システムのキャパシティーの決定は、HPLC のスケールの選択と呼ばれます。表 A に、さまざまな HPLC のスケールとそれらのクロマトグラフィーでの目的が示されています。

HPLC の固定相と移動相の特定の組み合わせによって選択性を最大にする能力（2 つの対象サンプル成分を可能な最大限に分離する）は、分離をスケールアップする要件を決定する上で、極めて重要です（HPLC 分離モードの説明を参照）。次にキャパシティーは、カラム容量（V_c）をサンプル注入量にスケーリングし、適切な粒子サイズを選択（圧力と効率を決定、分離能の説明を参照）する問題になります。カラム容量はベッド長（L）と内径（i.d.）の関数であり、これによって、含めることができる充塡剤（粒子）の量が決まります（図 L を参照）。

一般的な HPLC カラムは、長さ 20 mm ～ 500 mm、内径（i.d.）1 mm ～ 100 mm です。クロマトグラフィーのスケールが大きくなると、カラムの寸法（特に断面積）が大きくなります。スループットを最適化するには、移動相の流速を断面積に比例して増加させる必要があります。分離能を上げるするために粒子径を小さくすることが望ましい場合、ポンプを、高背圧条件下で移動相の高流速送液を維持するように設計されている必要があります。表 B に、各スケールのクロマトグラフィーに推奨する、カラム内径および粒子径の範囲の選択に関する簡単なガイドラインが示されています。

例えば、セミ分取スケールのアプリケーション（赤色の X）では、5 ～ 15 ミクロンの粒子が含まれている内径 10 ～ 40 mm のカラムを使用します。カラムの長さは、各分析で処理する必要がある精製された化合物の量と、必要な分離能に基づいて計算できます。