液体クロマトグラフィーの入門ガイド

基本的な高速液体クロマトグラフィー（HPLC）システムのコンポーネントが、略図 E に示されています。

リザーバーには、溶媒（これは移動するため、移動相と呼ばれる）を入れます。高圧ポンプ（溶媒送液システムまたはソルベントマネージャー）を使用して、指定された流量（通常は mL/分単位）の移動相を生成および送液します。インジェクター（サンプルマネージャーまたはオートサンプラー）は、サンプルを HPLC カラムに運ぶ移動相の連続的な流れを介して、サンプルを導入（注入）できます。カラムには、分離を達成するために必要なクロマトグラフィー充塡剤が含まれています。この充塡剤は、カラムハードウェアによって所定の位置に保持されるため、固定相と呼ばれます。HPLC カラムから溶出する分離された化合物のバンドを見るには、検出器が必要です（ほとんどの化合物には色がないため、目視で確認することはできません）。移動相は、検出器から出た後、必要に応じて廃液に送るか、回収することができます。HPLC では、移動相に分離された化合物バンドが含まれている場合、その精製化合物が含まれている溶出液のこのフラクションを、以後の研究のために回収できます。これは、分取クロマトグラフィーと呼ばれます（「HPLC スケール」セクションで説明されています）。

高圧チューブおよびフィッティングを使用して、ポンプ、インジェクター、カラム、検出器のコンポーネントを相互に接続して、移動相、サンプル、および分離された化合物バンドの流路が形成されます。

検出器は、コンピューターのデータステーションに接続されます。この HPLC システムのコンポーネントでは、クロマトグラムをディスプレイに生成するために必要な電気シグナルが記録され、サンプルの成分が同定され、その濃度が定量されます（図 F を参照）。サンプル化合物の特性は非常に異なることがあるため、いくつかの種類の検出器が開発されています。例えば、化合物が紫外線を吸収できる場合は、UV 吸光度検出器が使用されます。化合物が蛍光を発する場合は、蛍光検出器が使用されます。化合物にこれらの特性のいずれもない場合は、エバポレート光散乱検出器（ELSD）など、より汎用的な検出器が使用されます。最も強力なアプローチは、複数の検出器を直列に使用することです。例えば、UV および/または ELSD 検出器を、質量分析計（MS）と組み合わせて使用して、クロマトグラフィー分離の結果を分析できます。これにより、1 回の注入で分析種に関するより包括的な情報が得られます。質量分析計と HPLC システムを組み合わせる手法は、LC-MS と呼ばれます。

HPLC 操作

図 G に、サンプルに含まれている化合物を分離する方法を理解する方法の概要を示します。

移動相は、左からカラムに入り、粒子ベッドを通過して右から出ます。流れの方向は緑色の矢印で示されています。まず上の画像を見ていきましょう。時間ゼロ（注入の瞬間）でのカラムが示されています。このとき、サンプルはカラムに入り、バンドを形成し始めます。ここに示されているサンプルは、黄色、赤色、青色の色素の混合液であり、カラムのインレットで単一の黒色のバンドとして現れています。（実際には、このサンプルは、溶媒に溶解できるあらゆるものです。通常、化合物は無色で、カラム壁は不透明であり、溶出する分離された化合物を見るには、検出器が必要です。）

数分後に、移動相が連続して途切れずに充塡剤粒子を通過する間に（下の画像）、個々の色素が異なる速度で別々のバンドで移動するのがわかります。これは、移動相と固定相の間にそれぞれの色素または分析種を引き寄せる上で競合があるためです。黄色の色素のバンドが最も速く移動し、カラムからちょうど出るところです。黄色の色素の方が、他の色素よりもこの移動相を好んでいます（引き寄せられている）。したがって、この色素は、移動速度が速く、移動相に近い速度になっています。青色の色素のバンドは、移動相よりも充塡剤をより好んでいます。粒子により強く引き付けられるため、移動が大幅に遅くなります。つまり、この色素は、このサンプル混合物中で最もよく保持されている化合物です。赤色の色素のバンドは、移動相に対して中等度の親和性を示すので、カラムの中を中等度の速度で移動します。それぞれの色素のバンドが異なる速度で移動することにより、クロマトグラフィー分離が可能になります。

検出器とは？

分離された色素のバンドは、カラムから出るとすぐに検出器を通過します。検出器にはフローセルがあり、ここで各化合物のバンドが移動相のバックグラウンドに対して識別（検出）されます（図 H を参照）。（実際には、多くの化合物の溶液は、一般的な HPLC 分析濃度では無色です。）適切な検出器には、化合物の存在を検知し、それに対応する電気的シグナルをコンピューターのデータステーションに送る機能があります。先に説明したように、分離・分析する化合物の特性と濃度に応じて、多くのさまざまな種類の検出器から選択します。

クロマトグラムとは？

クロマトグラムとは、HPLC システムで化学的に（クロマトグラフィーにより）行われた分離を表すものです。ベースラインから立ち上がる一連のピークが時間軸に対して描画されます。各ピークは、異なる化合物に対する検出器レスポンスを表します。クロマトグラムは、コンピューターのデータステーションによってプロットされます（図 H を参照）。

図 H では、黄色のバンドが検出器のフローセルを完全に通過し、生成した電気的シグナルが、コンピューターのデータステーションに送られています。作成されたクロマトグラムが画面に現れ始めています。サンプルが初めて注入されたときにクロマトグラムの作成が開始され、画面の下部付近に描かれる直線として始まることに着目してください。これはベースラインと呼ばれ、時間の経過とともにフローセルを通過する純粋な移動相に対応します。黄色の分析種のバンドがフローセルを通過すると、より強いシグナルがコンピューターに送られます。この線は、サンプルのバンド内の黄色色素の濃度に比例して、最初に上向きにカーブし、次に下向きにカーブします。これによりクロマトグラムにピークが作成されます。黄色のバンドが検出器のセルから完全に出たら、シグナルのレベルはベースラインに戻り、フローセルには、再び純粋な移動相のみが含まれるようになります。黄色のバンドは最も速く移動し、カラムから最初に溶出するため、これが最初に描画されるピークとなります。

しばらくすると、赤色のバンドがフローセルに到達します。赤色のバンドがセルに入るとシグナルがベースラインから立ち上がり、赤色のバンドに対応するピークが描画されます。この図では、赤色のバンドはフローセルを完全には通過していません。この図は、この時点でプロセスを止める場合に、赤色のバンドと赤色のピークがどのように見えるかを示しています。赤色のバンドのほとんどがすでにセルを通過しているため、実線で示されているように、ピークのほとんどが描画されています。再開すると、赤色のバンドがフローセルを完全に通過し、赤いピークの描画が完了します（点線）。最も強く保持されている青色のバンドが最も遅い速度で移動し、赤色のバンドの後に溶出します。点線は、分析を最後まで継続した場合に、完了したクロマトグラムがどのように見えるかを示しています。興味深いことに、カラム上では青色の分析種のバンドの幅が最も狭いのに、カラムから溶出する時には最も広くなっています。これは、青色のバンドがクロマトグラフィー充塡剤のベッド内を移動する速度が遅く、完全に溶出するのにより多くの時間（および移動相容量）を要するためです。移動相は一定流量で連続的に流れているため、青色のバンドが広くなり、より希釈されます。検出器はバンドの濃度に比例して応答するため、青色のピークは高さが低く、幅が広くなります。