液体クロマトグラフィーの入門ガイド

一般に、HPLC 分離には化合物の 3 つの主要特性を利用します：

• 極性
• 電荷
• 分子サイズ

まず、極性、およびこの特性を利用する 2 つの基本分離モード、順相クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーについて考えていきましょう。

極性に基づく分離

分子の構造、活性、物理化学的特性は、その構成原子の配列およびそれらの結合によって決まります。分子内において、特殊な特性および予測可能な化学反応の原因となるある種の原子の特定の配列は官能基と呼びます。多くの場合、この構造により分子が極性か非極性かが決まります。有機分子は、それぞれに含まれている主要官能基によってクラスに分類されます。極性に基づく分離モードを使用する場合のさまざまな種類の分子の相対クロマトグラフィー保持は、これらの官能基の性質と位置によって大部分が決まります。図 P に示されているように、分子のクラスは、その相対保持によって、高極性から非極性までのクロマトグラフィー極性の範囲またはスペクトルに順序付けできます。

水（高い双極子モーメントを持つ低分子）は極性化合物です。ベンゼン（芳香族炭化水素）は非極性化合物です。クロマトグラフィー極性が類似の分子は互いに引き付け合う傾向があります。極性が似ていない分子は、引き付け合う力があるとしてもはるかに弱く、反発し合う場合すらあります。これが、極性に基づくクロマトグラフィー分離モードの基本になります。

身近な例から理解することもできます：油（非極性）と水（極性）は混ざり合いません。反対の極が互いに引き合う磁気とは異なり、極性に基づくクロマトグラフィー分離では、よく似た極性の間の強い引き合いと、反対の極性の間の弱い引き合いに頼ります。極性ベースのクロマトグラフィーでは、「似たものは似たものを引き寄せる」を忘れないでください。

クロマトグラフィー分離システム（図 Q を参照）を設計するために、異なる極性の移動相と固定相を選択することで、サンプルに含まれているさまざまな化合物の競合を発生させます。すると、固定相（カラム充塡剤）と極性が似ているサンプル中の化合物は、粒子により強く引き付けられるため、遅く移動します。極性が移動相の極性と類似している化合物は、優先的に移動相に引き寄せられ、より速く移動します。

このように、各化合物の各相に対する相対的な引き付ける力の差異に基づき、分析種の移動速度が変わることで分離が行われます。

図 R-1、R-2、R-3 に、移動相、固定相、サンプル分析種それぞれの、代表的なクロマトグラフィー極性範囲が示されています。極性に基づく HPLC 分離に必要な引力競合を発生させるために、適切な相を選択する方法を順番に考えていきましょう。

図 R-1 に示されているような、一部の一般的な溶媒が、相対的なクロマトグラフィー極性の順に並べられているスケールは、溶出系列と呼ばれます。固定相の引き付け部位に対して分析種分子と効果的に競合する移動相分子はこれらの分析種を押しのけるため、分析種はカラム内をより速く移動します（弱く保持されます）。水は移動相溶媒スケールの極性端にあり、脂肪族炭化水素であるヘキサンは非極性端にあります。その中間には、単一溶媒や混和性溶媒混合液（特定の分離要件を満たすために適切な比率で混合）が、溶出強度の順に並べられます。スケールのどちらの端が「最も強い」移動相になるかは、分析種分子の競合が起きる固定相表面の性質によって異なります。

シリカには、酸性シラノール官能基（アルコールのシリコン含有類似物）を持つ活性で親水性の表面があります。その結果、図 R-2 に示されている固定相のスケールの極性端に位置します。シリカ表面の活性または極性は、より低極性の官能基（結合相）をこれに化学的に結合することによって、選択的に変更できます。ここに示されている例には、極性が低下する順で、シアノプロピルシリル-（CN）、n-オクチルシリル-（C₈）、n-オクタデシルシリル-（C₁₈、ODS）を結合したシリカが含まれています。後者は、疎水性（水をひどく嫌う）で、非常に非極性の充塡剤です。

図 R-3 に、サンプルのクロマトグラフィー極性スペクトルが再び示されています（図 P を参照）。両方の相の極性を検討した後、対象の分析種が所定の固定相に対して保持されるが溶出されないほど強くない移動相を選択する必要があります。類似の強度の溶媒の中で、分析種の極性および溶解度のより微妙な差異を利用して、クロマトグラフィーシステムの選択性を最大化するために、どの相の組み合わせが最適であるかを検討します。「似たものは似たものを引き寄せる」と言いますが、これまでの説明から多分想像できるように、極性に基づく分離を作成することには、サンプルの知識、およびさまざまな種類の分析種や保持モードに関する経験が必要です。要約すると、移動相と粒子固定相には、適切な逆の極性を持つ最適な組み合わせを選択します。次に、サンプルの分析種がカラムを通って移動する際に、似たものは似たものを引き寄せるという規則によって、どの分析種が遅く、どの分析種が速く移動するかが決まります。

順相 HPLC

Tswett は、極性の固定相（ガラス製カラムにチョークを充塡、図 A を参照）を、はるかに極性の弱い（非極性）移動相と組み合わせて使用して、植物の抽出液の分離に成功しました。この古典的なモードのクロマトグラフィーは、順相として知られるようになりました。

図 S-1 に、当社の 3 色素試験混合液の順相クロマトグラフィー分離が、示されています。固定相は極性であり、極性の黄色の色素が最も強く保持されています。相対的に非極性の青色の色素は、非極性溶媒である移動相が保持の競合で勝つため、速く溶出しています。青色の色素は移動相に最もよく似ているため（両方とも非極性）、速く移動します。通常、シリカでの順相クロマトグラフィーでは移動相は 100% 有機溶媒であり、水は使用されません。

逆相 HPLC

逆相という用語は順相と正反対のクロマトグラフィーモードであることを表しています。つまり極性移動相と非極性（疎水性）固定相が使用されます。図 S-2 に、このようなプロトコルを使用した、黒色の 3 色素混合液の分離が示されています。

最も強く保持される化合物はより非極性の青色色素であり、その理由は非極性固定相に引き付ける力が最大だからです。極性の黄色色素は弱く保持され、極性の水系移動相が競合に勝ち、似たものは似たものを引き寄せるにより最も早く溶出します。

高い再現性と幅広い適用性をもつことから、現在すべての HPLC 分析法の約 75% では逆相が使用されています。これらのプロトコルのほとんどでは、移動相として、アセトニトリルやメタノールなどの水溶性の極性有機溶媒と水との水系混合液が使用されます。これにより通常、分析種と非極性の疎水性粒子表面との適切な相互作用が確保されます。C₁₈ 結合シリカ（ODS とも呼ばれる）が、最も使用されている逆相 HPLC 充塡剤の一種です。

表 C は、極性に基づく 2 つの主要 HPLC 分離モードの相の特性をまとめたものです。このような極性ベースのモードでは、似たものは似たものを引き寄せることを忘れないでください。

親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）

HILIC は、順相クロマトグラフィーの変種と見ることができます。順相クロマトグラフィーでは、移動相は 100% 有機溶媒です。移動相および極性充塡粒子の小孔の中に、微量の水しか存在しません。極性分析種は極性固定相と強く結合し、溶出しないことがあります。

有機移動相（通常はアセトニトリルのような非プロトン性溶媒）に少量の水（<20%）を加えると、順相モードで強く保持される極性化合物（逆相モードでは弱く保持される）を分離および溶出することができます。非常に極性の高い溶媒である水は、固定相に対して極性分析種と効果的に競合します。HILIC は、アイソクラティックモードまたはグラジエント溶出モードのいずれかで実行できます。（水を添加することで）移動相の極性（強度）を高くすると、最初に極性充塡粒子に引き付けられる極性化合物を溶出できます。分析種は、親水性が高い（水に対する相対的なクロマトグラフィー極性）順に溶出します。バッファーまたは塩を移動相に添加して、イオン性分析種を単一の形態のままに維持できます。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）

HIC は逆相クロマトグラフィーの一種で、タンパク質などの大きな生体分子を分離するために使用されます。通常、これらの分子は、水系溶液中で完全なままの状態を維持し、これらを変性させる有機溶媒や表面との接触を避けることが望まれます。HIC では、オクタデシル結合（C₁₈）シリカではなく、ブチル結合（C₄）シリカなどの適度な疎水性固定相と高分子の間の疎水性相互作用が利用されます。まず高い塩濃度の水で、タンパク質の充塡剤での保持が促進されます（塩析）。分離は通常、塩濃度を下げるグラジエントを用いて行われます。このように、生体分子は疎水性が大きい順で溶出されます。

電荷に基づく分離：イオン交換クロマトグラフィー（IEC）

極性に基づく分離では、似たものは似たものを引き寄せる、反対のものは反発しあいます。イオン交換クロマトグラフィーおよび電荷に基づくその他の分離では、この規則は逆になります。似たもの同士が反発しあい、反対のものが引き合います。イオン交換分離の固定相は、その表面の酸性官能基または塩基性官能基の性質と強度、およびそれらが引き付けて保持するイオンの種類によって、特性が示されます。陽イオン交換は、負電荷を持つ表面に陽イオンを保持および分離するために使用します。逆に、陰イオン交換は、正電荷を持つ表面に陰イオンを保持および分離するために使用します（図 T を参照）。各種類のイオン交換には、分離および溶出に少なくとも 2 つの一般的なアプローチがあります。

強イオン交換体には、常にイオン化されている官能基（第 4 級アミンやスルホン酸など）が含まれています。これらは通常、弱イオンを保持および分離するために使用します。これらの弱イオンは、移動相中の固定相部位により強く引き付けられるイオンに置換されて溶出することがあります。または、カラムに保持されている弱イオンは、そのまま中和して移動相の pH を変えて、イオンの引き付けがなくなり、溶出することがあります。

弱イオン交換体（第 2 級アミンやカルボン酸基など）は、特定の pH 値よりも上または下の値で中和され、電荷によってイオンを保持する能力を失うことができます。これらが荷電すると、強イオンを保持および分離するために使用されます。置換によってこれらのイオンを溶出できない場合は、固定相の交換部位を中和してイオンの引き付けを遮断することで、荷電した分析種を溶出できます。

弱イオン交換体が中和されると、疎水性（逆相）相互作用または親水性（順相）相互作用によって分子種が保持および分離されます。これらの場合、溶出力は移動相の極性によって決まります（図 R-1）。このように、弱イオン交換体は、ミックスモード分離（極性と電荷の両方に基づく分離）に使用できます。

表 D に、イオン交換の主要カテゴリーのガイドラインが示されています。例えば、強塩基性分析種（常に正に荷電）を保持するには、弱陽イオン交換固定相粒子を pH > 7 で使用します。これにより、粒子表面は確実に負の電荷を持ちます。強塩基を遊離または溶出するには、移動相の pH を 3 未満に下げます。これにより、表面電荷が除去され、イオン交換保持メカニズムが遮断されます。

pK_a は、官能基の 50% がイオン化され、50% が中性である状態の pH 値です。基本的に中性または完全に荷電した分析種または粒子表面を確保するには、必要に応じて、pK_a を 2 単位以上上回る値に pH を調整する必要があります（表 D を参照）。

強塩基を保持するために強陽イオン交換体を使用しないでください。この両者は荷電したままで互いに強く引き付け合い、塩基を溶出することがほぼ不可能です。これは、多量のより強い保持を示す競合塩基で強陽イオン交換体を無力にし、活性交換部位での競合に勝って対象化合物を置換することによってのみ、取り除くことができます。このアプローチは、HPLC や SPE ではあまり実用的でも安全でもありません。（非常に強い酸および塩基の使用は危険であり、また、HPLC の流路系で使用されている材質が腐食する可能性があります。）

サイズに基づく分離：サイズ排除クロマトグラフィー（SEC） – ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）

1950 年代に、Porath と Flodin は、生体分子をコントロールされた多孔性の親水性デキストランポリマーに通過またはろ過させることにより、電荷や極性ではなくそのサイズに基づいて分離できることを発見しました。このプロセスはゲルろ過と名付けられました。その後、類似のスキームを用いて、特定の孔径範囲の有機ポリマー充塡剤を使用して、合成オリゴマーおよび合成ポリマーが分離されました。このプロセスは、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）と呼ばれました。コントロールした多孔性のシリカ充塡剤を使用して行う同様の分離は、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）と呼ばれました。1963 年に導入された初の市販の HPLC 装置は、GPC アプリケーション用に設計されました（参照文献 3 を参照）。

これらの手法はすべて、通常は充塡剤のポアボリュームとほぼ同程度の、対象分析種が入ることができるまたは排除される範囲の細孔径分布を持つ、合成された固定相で行われます。より小さな分子は、ベッドを通過する際に、より多くの細孔の中を通ります。より大きな分子は、特定のサイズを超える細孔のみを通ることができるため、ベッドで費やす時間が短くなります。最も大きい分子は、細孔から完全に排除され、粒子の間を通過するだけであり、少量で非常に速く溶出します。移動相は次の 2 つの理由から選択されます。1 つは分析種に適した溶媒であること、もう 1 つは分析種と固定相表面の間の（極性または電荷に基づく）相互作用を防止できることです。このように、大きい分子が最初に溶出し、小さい分子は（より多くの細孔に出入りするため）ゆっくり移動し、溶液中のサイズの降順で、遅れて溶出します。これにより、大きなものが最初に出てくるという単純な規則が成り立ちます。

ポリマーの分子量とその溶液中のサイズを相互に関連付けることができるため、GPC によって、ポリマーの分子量分布の測定に改革がもたらされ、ポリマーの加工処理、品質、性能を高めるまたは損う物理特性が測定（良いポリマーと悪いポリマーを区別する方法）できるようになりました。

まとめ

HPLC の簡単な紹介を楽しんでいただけたら幸いです。さらに参考文献や付録：HPLC の用語を参照することをお勧めします。