UPLC初学者指南

从最基本的意义来讲，色谱分离度就是指两个峰的宽度[w]与它们之间距离[t_R,2–t_R,1]的关系。如果我们能够让两个峰变窄或使它们的距离变远，就能提高分离度。

可以使用基本分离度方程通过多个相关项对分离度进行数学表达。分离度方程包含影响色谱分离度的物理和化学参数：柱效[N]、选择性[α]和保留性[k]。其中，选择性和保留性一直被视为在提高分离度方面比较容易控制的化学因素。这些参数可能会随着温度、洗脱溶剂、流动相组分和色谱柱填料等的变化而受到影响。柱效是物理[机械]参数，比较难以控制，因为其平方根会影响分离度。然而，如果粒径很小，柱效就会对分离度产生重大影响。UPLC技术侧重于通过采用亚2 µm颗粒改善系统效率，从而提高分离度。

如果我们能够了解这些参数在色谱分析中的表示方式，也就更容易理解它们对分离度产生的影响[图15]。保留性[k]和选择性[α]都属于化学因素，会使各峰相对于彼此移动，同时也是衡量分析物与固定相和流动相之间相互作用的一个指标。我们可以通过增加k提高分离度。但是，这会导致保留时间变长、灵敏度变低以及峰变宽。增加α也是提高分离度的一种方法，这样做可以在相似时间内得到相同的峰洗脱顺序和/或发生改变的洗脱顺序。柱效[N]是表示分离中谱带展宽的一个物理量。假设通过减小填料粒径提高N，此时峰与峰之间的中心距离不会改变。此外，减小粒径会使色谱峰更窄、更高效，从而提高分离度和灵敏度。

分离度、柱效和粒径之间的关系

UPLC技术通过尽可能减小仪器谱带展宽来提高对分离度的物理[机械]影响，从而能够使用柱效更高、颗粒更小的色谱柱[1.7 µm–1.8 µm]。简单的色谱示例和基本算法有助于用户更好地理解UPLC技术的色谱原理。

正如基本分离度方程所示，分离度与柱效的平方根成正比。

此外，柱效与粒径成反比。这意味着，如果减小填料的粒径，就能提高分离效率。比如，如果将填料的粒径从5 µm减小到1.7 µm [3倍]，理论上预计柱效会增加到3倍，此时分离度将增加到1.7倍[3的平方根]。

要实现理论上预测的柱效和分离度提升，必须根据粒径选择理想流速。理想流速[F_opt]与粒径成反比。这意味着，如果将粒径从5 µm减小到1.7 µm [3倍]，则检测该颗粒的理想流速增加到3倍，这将使分析时间也出现相同程度的缩短[3倍]，由此可以提高样品通量。

作为色谱工作人员，我们首先需要观察的一点是，改变色谱流速时会发生什么情况。如果增大流速，分析运行时间会缩短。此外，峰宽也会减小。随着峰宽变窄，峰高会成比例增加。峰越窄、越高，越容易检测和区分基线噪音[S/N更高]，从而可以提高灵敏度。

这些理论原理已应用到了色谱分析中。如图20所示，当尽可能地减小ACQUITY UPLC仪器的柱外谱带展宽时，色谱柱可以达到理论性能。

以上论述证明了柱内谱带展宽的重要性。如果用户能够深入了解哪些过程会影响谱带展宽以及如何减小这种影响，就能提高柱效，进而提高分离度。

了解van Deemter曲线

如前所述，可以将峰宽视为分析物分子的统计分布[方差σ²]。峰宽随峰移动距离的增加成比例地线性增加。峰宽与峰移动距离的关系称为理论塔板高度[HETP或H]。H来自蒸馏理论，是衡量色谱柱性能的一个指标，它将多个谱带展宽相关过程都纳入了考虑。通俗地说，HETP越小，色谱柱的塔板数[N]越多[图21]。

如果我们了解色谱柱内分子层面的情况[分析物分子与流动相和固定相如何相互作用]，就能进一步了解当前影响色谱性能的不同扩散相关过程[图22]。

以下几种扩散相关过程会同时进行：

1. 分析物分子被传递到颗粒表面及其周围[涡流扩散]
2. 分析物分子在填料流动相中来回扩散[纵向扩散]
3. 分析物分子扩散进出色谱孔[传质]。

可以使用van Deemter方程从数学层面表达这些扩散相关过程。

van Deemter方程由以下三项组成：

• A项[涡流扩散]主要与填料的粒径有关。它的值还取决于色谱床的填充程度。此外，它还与流向和围绕颗粒的流体的均匀性或非均匀性有关。
• B项[纵向扩散]与分析物在填料流动相中和固定相上的扩散有关，并且会随着流动相速度[线速度]的增加而减小。
• C项[传质]与线速度[流动相速度]及粒径的平方有关。传质涉及分析物分子与固定相内表面的相互作用及其扩散进出填料孔的距离。

我们可以将HETP和流动相线速度[u]分别作为坐标绘制这些项的图表，从而单独观察它们[图24]。

在图中，A项是一条水平线。它与粒径及色谱柱的填充程度有关，与线速度[流动相速度]无关。随着填料粒径的减小，H值也会减小[柱效更高]。

B项是一条随着线速度增加而逐渐向下倾斜的曲线。该项与粒径无关，它表示如果流动相以较慢的线速度移动，分析物分子会在色谱柱内停留较长时间，这很可能会引起色谱柱内的谱带纵向展宽[扩散]。相反，如果流动相以较快线速度移动，扩散时间就会缩短，发生谱带展宽现象的可能性也随之降低。

C项表明H和u之间存在线性递增关系。在分子分布中，有些分子进入固定相孔，有些则留在移动的流动相中，直到遇到其他颗粒。随后会发生相反过程，在该过程中，固定的分子发生分离并进一步沿着色谱床向下移动。分子进出孔需要时间，因此，当分子从一个颗粒转移到下一个颗粒时，含有这些分子的分析物谱带会在沿着色谱柱向下移动时变宽。固定相颗粒越小，该过程发生得越快，从而阻止分析物谱带展宽。如果流动相移动得很快，则固定的分子与向前移动的分子之间会出现较大距离。这表明，要使分析物分子群保持在一起，流动相应以较慢的线速度移动。随着流动相速度的增加，分析物分子群将会变得更加分散，这将导致谱带展宽增大。

将A、B和C项合并在一起，就得到了van Deemter曲线[图25]。以曲线中最低点对应的线速度进行分离将能得到优异柱效，从而实现理想的色谱分离度。

如果将其与图23中所示的van Deemter方程相关联，并且将粒径减小一半，则H将会缩小为原来的二分之一。因此，可以通过使用较小的颗粒来减小色谱柱内的谱带展宽。

比如，图26以van Deemter图描述了10 µm颗粒和5 µm颗粒。如图所示，对于10 µm大颗粒，要达到较低的H值[18 µm，0.7 mm/s时]，只能在一个较窄的范围内调整线速度。流动相速度过慢或过快都会使H值增大[柱效降低]，从而导致色谱分离度和灵敏度降低。然而，5 µm颗粒不仅能在更高的流动相速度下实现更低的H值[10 µm，0.95 mm/s时；柱效提高]，达到低H值所需的线速度范围也更宽。这意味着，与填充10 µm大颗粒的色谱柱相比，填充更小颗粒的色谱柱能够更快地提高柱效，进而提高分离度。

要详细了解这种效应，我们可以进一步研究粒径对van Deemter方程各项的影响。

粒径对分析物谱带具有显著影响，因为它与A项[涡流扩散]相关。随着粒径减小，分析物分子从填料流动相转移到颗粒表面和颗粒周围所需的时间会更短。如果颗粒比较大，分析物分子移动的路径会更长、更曲折。这些路径之间的差异会造成群内分析物分子的移动时间不同，进而导致分析物谱带和峰变宽。随着填料粒径的减小，分析物分子的移动路径长度也应该更相近。此时分析物谱带变窄，从而得到更窄的峰以及更高的柱效和灵敏度[图27]。

纵向扩散（B项）不直接受粒径影响。然而，随着粒径减小，van Deemter方程的其他参数（A和C项）也会减小。最终，理想线速度[流动相速度]增加，谱带展宽现象减少。减慢线速度会延长分析物分子谱带与填料相互作用的时间。这意味着，轴向[纵向]扩散进入流动相的时间更长，这会导致分析物谱带展宽、扩散得更严重。当线速度更高时，分析物分子群会在较短时间内通过色谱柱，这会使分析物谱带更集中，从而得到更窄、更高效的峰，这是纵向扩散时间缩短的结果[图28]。

C项[传质]受线速度和粒径的影响。分析物分子群从流动相传递到颗粒表面。然后，分析物分子通过孔穿过流动相移动到键合表面层（例如，C₁₈、C₈），与键合相相互作用，然后再从孔流出进入填料流动相。然而，群中分析物分子进出孔的程度不同。这意味着，当分子返回填料流动相时，每个分析物分子经过的路径长度不同，从而导致分析物谱带展宽[变宽][图29]。谱带展宽程度取决于流动相速度[图30]。

在较高的线速度下，分子与颗粒表面相互作用且通过流动相传递的时间会延长。流动相速度越快，分析物分子通过色谱柱的速度就越快，这会导致分析物谱带展宽、更分散。由此，色谱峰会变宽，灵敏度会降低。

线速度较慢时，与表面相互作用的长度变短。这会导致分析物谱带更集中，色谱峰更窄、更高效。

粒径减小时，传质会明显改善，这是因为传质与粒径的平方[d_p²]相关。如果减小颗粒，对于分析物分子而言，进入孔并与色谱表面相互作用再返回到流动相中所需的时间会更短。因此，在小颗粒色谱柱中，分离的分析物分子扩散得更快，因而色谱带更尖、更窄、更高效[图31]。

由此可见，减小粒径能够改善传质，从而能够有效降低C项的斜率，据此，我们开发了现在的UPLC技术。如图32中的van Deemter图所示，3.5 µm颗粒的HETP值是1.7 µm颗粒的2-3倍。此外，可以在较高的线速度下、较大的速度范围内达到这样小的H值。这意味着，减小颗粒可以明显改善传质，从而实现更高的柱效和分离度。这也表明，可以通过扩大线速度范围实现这种性能提升。用户能够以更快的线速度进行分离，从而提高分析速度，而不会影响分离度。

柱外[仪器]谱带展宽对van Deemter图的影响

随着UPLC技术在色谱实验室领域发展势头强劲并已得到普及，van Deemter图已经成为一种常用的方法，用于测量亚2 µm色谱柱相对于现有HPLC色谱柱所实现的性能提升。如果未对仪器执行这种比较测量以尽可能地减小柱外谱带展宽的影响，则可能会得出错误的结论。

我们针对传统HPLC仪器生成了van Deemter图[谱带展宽 = 7.2 µL]，比较了1.7 µm色谱柱和2.5 µm色谱柱[图33]，旨在说明柱外谱带展宽对性能测定的重要性。两种色谱柱的颗粒基质和键合相化学物质相同。初看之下，根据van Deemter图推断，这两种色谱柱的性能没有明显差异。这是怎么回事呢？

在本例中，HPLC仪器的谱带展宽导致1.7 µm UPLC色谱柱与2.5 µm HPLC色谱柱的性能测定结果相似。相比填充较大颗粒（如2.5 µm）的色谱柱，1.7 µm UPLC色谱柱产生的峰宽较小，受柱外谱带展宽的影响明显更大，这样就会得到这种具有误导性的结果。

然后，在ACQUITY UPLC仪器上进行相同实验[谱带展宽 = 2.8 µL]。与HPLC仪器相比，ACQUITY UPLC仪器的系统体积约小84%，谱带展宽小60%。

如图34所示，在ACQUITY UPLC仪器上操作时，这两种色谱柱的性能存在明显差异。不仅观察到HETP存在差异，还发现理想线速度从3.0 mm/s [2.5 µm 颗粒]增加到了10.0 mm/s[1.7 µm 颗粒]，这表明UPLC技术的性能有所提升，即HETP更小[柱效更高]、线速度更高[通量由此增加]。

可以在不影响性能的情况下保持分离完整性

现在，我们已经基本了解柱外和柱内谱带展宽的作用，因此可以将这些项[HETP与线速度]的测量值进行更实际的关联（比较塔板数与流速）。

如前所述，线速度是流动相流过色谱柱的速度。该参数用于独立于色谱柱内径之外标准化流动相流速，以便测定和比较不同尺寸色谱柱的性能。理想线速度与理想流速直接相关[图35]。传统HPLC色谱柱只有在较窄流速范围内操作时，才能达到理想性能。如果在该范围之外操作，预计性能会下降。

在传统HPLC中，缩短分析时间[提高通量]的常用方法只是增大流速。如果颗粒比较大，增大流速通常会导致柱效大幅降低，进而导致分离度降低，这是因为现在已经是在HPLC色谱柱[压缩色谱法]的理想线速度以上进行操作。这是需要在与HPLC相关的色谱性能和分析速度之间做出的一项重要折衷选择[图36]。

有了UPLC技术，用户不再需要进行这种折衷选择。UPLC技术可以在不牺牲性能的情况下缩短分析时间。将粒径从3.5 µm减小到1.7 µm时，可观察到柱效显著提高[图37]。这是因为在1.7 µm UPLC色谱柱中，柱内谱带展宽可以忽略不计，色谱带比较窄。此外，在较高流速下也能实现这种柱效提升[图37]。这意味着，若柱长相同，可以在较短分析时间内显著提高柱效，进而提高分离度。

了解色谱柱分离能力[L/dp]

色谱分离的主要目标是将不同的组分进行分离，从而测定部分或全部组分。通过将色谱柱柱长[L]除以粒径[d_p]，可以估算出色谱柱理论上的最大分离能力。L/d_p比率有助于确定在给定应用中可能需要使用的填料粒径和色谱柱柱长[图38]。

该比率也可以作为一种方法转换工具，用于在不同粒径间转换方法。L/d_p比率为30,000[中等难度的分离]的色谱柱是很常见的选择。如图39所示，典型HPLC色谱柱的分离能力是30,000，柱长是150 mm，填充5 µm颗粒。如果粒径减小，可以通过缩短柱长以获得相同的分离能力[这意味着分析时间更短；即，填充1.7 µm颗粒的50 mm长色谱柱可以达到30,000的L/d_p 比率]。除了色谱柱柱长缩短外，粒径减小还会使理想流速增加，这将能进一步缩短分析时间。

通过色谱分析可以更清楚地说明这一点[图40]。填充1.7 µm颗粒的50 mm长UPLC色谱柱与填充5 µm颗粒的150 mm长HPLC色谱柱具有相同的分离能力。通过保持L/d_p比率不变，可以将分析时间缩短为原来的十分之一，同时保持相同的分离能力。流速均按照粒径反比例调整。按照柱体积成比例调整进样体积，使色谱柱载样量相同。

了解色谱柱柱长/粒径比率[L/d_p]的作用对于了解UPLC技术很重要。UPLC技术设计的依据是，将耐压的小颗粒有效填充到短[高通量]或长[高分离度]色谱柱中。这种UPLC色谱柱适用于LC仪器，能够针对此类颗粒在理想线速度[及由此产生的压力]下运行且谱带展宽极小。

测定梯度分离性能[峰容量]

在等度操作条件下，塔板数[N]是衡量仪器和色谱柱累积谱带展宽影响的一个指标。由于扩散会引起谱带展宽，因此分析物谱带分布宽度增大，其在固定相中保留的时间就会延长。

梯度运行时，流动相的洗脱强度在分析过程中会发生改变。这会导致保留较强的分析物谱带更快地通过色谱柱[从而改变保留时间]，同时还会使谱带更集中[窄]。在反相色谱中，由于流动相的洗脱强度不断增加限制了谱带分布宽度，因此在谱带通过检测器时产生相近的峰宽。由于峰宽和保留时间会随流动相强度的变化而改变，因此塔板数[与峰宽有关]并不是衡量梯度分离的有效指标。

可以根据峰容量[P_c]计算梯度的分离能力。因此，峰容量只是在给定梯度时间内能够分离的理论峰数。峰容量与峰宽成反比。因此，要增加P_c，必须减小峰宽。

借助UPLC技术，可以显著增加峰容量。高分辨率UPLC技术通过在扩散性极低的仪器[2.8 µL谱带展宽]上采用亚2 µm色谱柱，能够在单位时间内生成更多信息。这有利于从给定样品中获取更多信息。比如，在填充5 µm颗粒的HPLC色谱柱上，对胰蛋白酶酶解磷酸化酶b进行分析，可以鉴定大约70个峰[图43A]。而通过UPLC技术，可鉴定峰数能从70个增加到168个，从而可以提高蛋白质鉴定的可信度[图43B]。