UPLC初学者指南

在前面的章节中，已阐明使用较小的色谱颗粒和尽可能减小系统谱带展宽[仪器和色谱柱]的好处。借助UPLC技术可通过尽可能减小系统谱带展宽以更快更高效地进行分离，从而实现色谱性能改善，由此获得更高质量的数据。然而，除了谱带展宽之外，小颗粒填料也会影响系统性能。此外，色谱仪的有效压力也对性能有着很大的影响。

在流动相通过泵到进样器、进样器到色谱柱的连接管路，流向色谱柱、柱后管路以及检测器流通池的过程中，流动相自身会产生压力。所测量的系统压力是所有这些组件[仪器和色谱柱]的累积效应。流速增加时，流动相流经连接管路产生的压力也会增加。此外，管路的直径、长度以及流速也会影响其产生的压力。如果从总系统压力[仪器+色谱柱]中扣除仪器自身产生的压力，此时可以将两根色谱柱间的压力差异与理论预测压力进行比较。

粒径减小时，反压会按一定比率增加，与颗粒直径的平方成反比。同时，流动相的理想流速[线速度]随颗粒直径的减小而增加。因此，对于给定的粒径，理想线速度的压力按一定比率增加，与颗粒直径的立方成反比[图44]。

当试图在传统HPLC色谱仪上使用小颗粒色谱柱以提高色谱分离度[保持柱长不变，同时减小粒径]或提高分析速度并且维持分离度[保持L/d_p比值恒定]时，压力是一项重要的限制因素。由于传统HPLC仪器的压力限制 [350–400 bar; 5000–6000 psi]，使用小颗粒色谱柱通常会受到柱长的限制或不得不以次优线速度[流速]运行。

当柱长保持不变时，如果粒径从5.0 µm减小到1.7 µm[粒径减小为原来的三分之一]，理论预测反压将增加至27倍。将柱长相同的5.0 µm色谱柱换为1.7 µm色谱柱时，系统压力增加22倍，接近理论预测值。由实测可见，1.7 μm色谱柱的运行压力远高于传统HPLC仪器的压力上限[图45]。

在推出ACQUITY UPLC系统之前，减小粒径会导致反压大幅增加，这是亚2 μm颗粒色谱柱[以及相应的LC仪器]没能商业化的主要原因。

如果分离目标是维持分离度并缩短分析时间[保持L/d_p比率恒定]，则压力增幅远少于保持柱长不变同时减小粒径的情况。由于柱长按比例减少，因此压力的变化与粒径的平方[而不是粒径的立方]成反比。

在本示例中，柱长和粒径均减小为原来的三分之一[图47]。这意味着反压预计增加至9倍。实测值与理论预测值接近。保持L/d_p恒定，将5.0 µm、150 mm长色谱柱替换为1.7 µm、50 mm长色谱柱时，测得反压增加至11倍。

当以理想流速运行时，小颗粒产生的压力会超过传统HPLC系统的压力限。ACQUITY UPLC系统[压力上限为1030 bar, 15,000 psi]能够承受这些压力，确保亚2 μm颗粒色谱柱能在理想流速下运行。

升温

对于小颗粒填料色谱柱产生的较高压力，一种弥补方法是提高柱温。柱温升高时，流动相粘度减小，柱压降低[如果流速恒定]。然而，分析物分子进出固定相孔[扩散]的速度也会随之增加，因此需要增加流速来维持性能。

当柱温从30 °C升至90 °C时，必须增加流速来维持效率[图48]。当在任一温度下比较最高塔板数时，不会测得效率增加，这与色谱理论一致。

塔板数-系统压力图展示了有趣的对比结果[图49]。如图所示，各分离温度中达到理想柱效时的系统压力都大致相似。这表示提高温度无法避免由于使用小颗粒填料而产生的压力。换言之，无法在传统HPLC色谱仪上高效使用非常小颗粒的色谱柱。