UPLC初学者指南

借助UPLC技术提高生产率

整体系统设计

通过了解本入门指南中概述的色谱原理和色谱应用方法可发现，为了尽可能提高分离性能，仅考虑小颗粒和更大压力显然不够。为了实现亚2 μm颗粒柱的色谱效益，必须在特别设计的仪器上运行这些色谱柱，以承受小颗粒产生的压力和尽可能减小谱带展宽。传统HPLC系统无法实现这一点。

ACQUITY超高效液相色谱系统是一套整体设计的解决方案，全面考量了仪器和色谱柱的设计，提高了色谱分离的性能和分析数据质量。

图50：整体设计的UPLC技术。

现在应该清楚，UPLC分离的关键在于仪器和色谱柱性能的组合，这些性能可以帮助色谱工作人员充分了解和利用亚2 µm颗粒色谱柱的功能。而要实现这些性能，需要尽可能减小色谱柱内[柱内]和外[柱内]的谱带展宽，并且能够在这些小颗粒色谱柱的理想线速度下运行[图51]。

图51：对于亚2 µm颗粒色谱柱而言，能够在快速、低谱带展宽的LC仪器上使用，并且可以在理想线速度下运行，都是实现色谱柱性能提升的关键。在本示例中，使用相同的色谱条件[除注明的流速外]在充分优化的微孔HPLC仪器和标准的ACQUITY UPLC仪器上，对四种咖啡因代谢物进行分析。柱效、分离度、峰形和峰高均有提升，体现了UPLC技术和色谱仪的整体系统设计所具备的优势。

尽可能提高分离能力

为了尽可能提高分离能力，用户可使用高温和高压的小颗粒色谱柱，通过UPLC技术实现超高效分离。

图52A中，单根150 mm长的1.7 µm UPLC色谱柱在90 °C下生成的塔板数低于40,000。串联一根色谱柱使长度变为300 mm，得到的塔板数为83,000[图52B]。再串联一根色谱柱，即总共三根色谱柱，得到UPLC色谱柱长为450 mm，仍采用1.7 µm颗粒填充，此时ACQUITY UPLC系统的压力范围得到充分开发。如图52C所示，仅8分钟就达到了121,000的塔板数。

图52：结合高温和UPLC技术，尽可能提高塔板数。

相同的逻辑也可用于提高梯度分离能力。在本示例中，将两根150 mm长的1.7 µm UPLC色谱柱[总长300 mm]串联，从而显著提高代谢物鉴定获得的信息量[图53]。在1小时的运行中，峰容量超过1000。这种充分表征尿样的能力可用于鉴定候选药物的代谢物、检测和鉴定毒性标志物和在治疗药物监测中检测毒素。在本例中，分离能力和谱图质量均有显著提高，有助于简化数据分析、提高检测限以及提高分析可信度。

图53：结合高温和UPLC技术，尽可能增大糖尿病患者尿样的峰容量。

HPLC和UPLC分离的集成系统

ACQUITY UPLC系统旨在应对日益严峻的组织挑战，帮助产品尽快上市，同时维持或提高信息质量。2004年以来，大多数组织采用UPLC技术作为常规分析平台，取代了传统HPLC。

采用一种新技术时，考虑其是否能满足当前和未来的需求至关重要。借助UPLC技术，用户可使用出色运行亚2 µm色谱柱并且稳定运行传统HPLC方法的集成系统，更好地着眼于未来。这表明集成技术平台的使用不受分离需求的影响，这有利于通过简化系统间的方法转移来提高生产率。

图54显示了将ACQUITY UPLC系统作为标准HPLC系统运行的示例。这是在传统HPLC系统[图54A]和ACQUITY UPLC系统[图54B]上检测Excedrin[非处方类止痛药]的USP方法。色谱方法、流动相、样品和色谱柱都是简单地从一台仪器转移到另一台仪器。得益于系统设计的优化，在使用ACQUITY UPLC系统进行相同检测时，可观察到更高的效率和灵敏度，而选择性和相对保留时间均没有变化。

图54：ACQUITY UPLC仪器作为标准HPLC的性能。XBridge C18 4.6 x 100 mm，5 µm色谱柱，流速为2.0 mL/min，温度45 °C，流动相 - 水:甲醇:乙酸的比例为73:23:3。检测波长为275 nm，5 Hz，数字滤光器= 0.1。

结论

本技术入门指南旨在帮助读者对UPLC技术的色谱原理知识有基本了解。我们期望读者在阅读后能够理解的是，从仪器和色谱柱入手尽可能减小谱带展宽，可显著提高色谱分离的分离度、灵敏度和分离速度。除了尽可能减小谱带展宽，还需要系统能够以理想线速度[和压力]运行小[亚2 µm]颗粒色谱柱。ACQUITY UPLC系统旨在满足分离科学家当前和未来的需求。

本入门指南中介绍的理论效率和分离度提升均已在数十年前被预测。2004年推出的ACQUITY UPLC系统率先将理论变为现实，并且成功实现商业化。自此，上千名世界各地的分离科学家采用了UPLC技术，为他们所在的组织带来了实际效益。ACQUITY UPLC系统通过提高色谱信息质量，缩短采集信息所需的时间，帮助各公司高效管理资产。这克服了分析分离实验室所面临的挑战和瓶颈，从而提高了组织的生产率。此外，由于所需的有机溶剂明显减少，极大降低了消耗成本，更快、更稳定的分离也有利于环境保护。

有意思的是，大多数业内出色的仪器制造商一开始就低估了较高压力色谱系统的重要性[认为存在安全性、稳定性和样品兼容性等问题]，如今，这些制造商开始承认LC平台的必要性，并且自主开发了多种可承受较高压力的系统。尽管这些系统不尽如人意[例如，压力限较低、谱带展宽较大、检测选择有限等]，但这符合提升色谱性能的趋势，表明分离科学的发展从未止步。

可供进一步阅读的参考书目：

U.D. Neue, “HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice,” Wiley-VCH [1997]
J.C. Aresenault and P.D. McDonald, “Beginners Guide to Liquid Chromatography,” Waters [2009]
P.D. McDonald, “The Quest for Ultra Performance in Liquid Chromatography: Origins of UPLC Technology,” Waters [2009]
M.P. Balogh, “The Mass Spectrometry Primer,” Waters [2009]