UPLC初学者指南

将样品混合物从样品瓶转移到流动的流体中[流动相]。然后，载有样品的流动相将通过高压泵输送至色谱柱柱头。流动相和进样的样品混合物进入色谱柱，流过颗粒柱床，然后排出，将分离后的混合物转移到检测器中[图3]。

我们先来看看样品谱带是怎样被分离成单个分析物谱带的[流动方向用绿色箭头表示]。图4A表示时间零处[进样时刻]的色谱柱，此时样品进入色谱柱并开始形成谱带。此处显示的样品为黄色、红色与蓝色染料的混合物，在色谱柱入口处显示出一个黑色谱带。

几分钟后，流动相连续而稳定地流过填料颗粒，这时我们可以看到各染料速度各异地以条带的形式移动[图4B]。这是由于流动相和固定相之间竞争吸引各种染料或分析物。请注意，黄色染料带移动最快，即将流出色谱柱。与其他染料相比，黄色染料对流动相有更大的亲和力[容易被吸引至流动相]。因此，它的移动速度更快，更接近流动相。蓝色染料带对填料的亲和力大于流动相。它对颗粒更强的吸引力使其移动得比其他染料明显更慢。换句话说，它是样品混合物中保留时间最长的化合物。红色染料带对流动相的吸引力大小介于另外两个染料之间，因此以中间速度通过色谱柱。由于每个染料带的移动速度不同，我们能够用色谱法分离混合物。

谱带是如何形成色谱峰的

每个特定的分析物谱带由许多分析物分子组成。谱带中心分析物分子的浓度最高；当与流动相接触时，谱带的前缘和后缘的浓度相对较低[图5]。

当分离的染料带流出色谱柱时，它们立即进入检测器。检测器在流动相背景下观察[检测]每个经过分离的化合物谱带[见图6]。合适的检测器[UV、ELS、荧光、质谱等]能够感知化合物的存在，并将其相应的电信号发送到计算机数据工作站，在那里记录为谱峰。检测器对谱带内特定分析物分子浓度的变化作出响应，其中谱带的中心[分析物分子最多]被检测器定为峰的顶点。

什么是色谱图？

色谱图反映了在HPLC系统中发生的化学[色谱]分离。横轴是时间轴，上面绘制了从基线上升的一系列峰。每个峰代表不同化合物的检测器响应。色谱图由计算机数据工作站绘制[见图6]。黄色谱带已完全通过检测器流通池；产生的电信号已发送到计算机数据工作站。所得色谱图已开始显示在屏幕上。请注意，当样品第一次注入时，色谱图就开始生成了，色谱图开始时是一条直线，位于界面底部附近。这条直线被称为基线；它代表随着时间推移流过流通池的纯流动相。当黄色分析物谱带通过流通池时，将向计算机发送一个信号[根据分析物分子的浓度而变化]。曲线先向上，然后向下，与样品谱带中黄色染料的浓度成正比。这样就在色谱图中形成了一个峰。黄色谱带完全通过检测器流通池后，信号水平恢复基线；现在，流通池中再次只有纯流动相。由于黄色谱带移动速度最快，先从色谱柱上洗脱下来，因此它是第一个绘制的峰。片刻之后，红色谱带到达流通池。当红色谱带第一次进入流通池时，信号从基线上升，代表红色谱带的峰开始绘制。在此图中，红色谱带尚未完全通过流通池。图中展示了如果我们此时停止该过程，红色谱带/峰会变成什么样。由于大部分红色谱带已通过流通池，因此绘制了大部分色谱峰，如实线所示。如果我们继续色谱过程，红色谱带将完全通过流通池，红色染料的色谱峰将绘制完成[虚线]。蓝色谱带保留性最强，移动速度最慢，在红色谱带之后洗脱。虚线则显示了如果我们让实验继续进行下去，最终完成的色谱图将呈现的样子。有趣的是，蓝色谱带峰的宽度是最宽的，因为蓝色分析物谱带的宽度虽然在色谱柱上最窄，但流出色谱柱后就变得最宽。这是因为它在色谱填料床中移动更慢，需要更长时间[和更多的流动相体积]才能完全洗脱。由于流动相以固定速率持续流动，会导致蓝色谱带变宽，稀释程度更高。而检测器的响应值与谱带的浓度成正比，因此蓝色谱带峰的峰高较低且峰宽更宽。

谱带展宽

在样品/分析物谱带到达检测器之前，它将通过色谱系统的多个部分，这会导致谱带出现畸变和展宽[图7]。这种现象称为谱带展宽。随着分析物谱带变宽，所产生色谱峰的宽度也会同样增加。更宽的谱带会产生稀释效应，导致峰高降低，同时也会导致灵敏度和分离度降低。相反，如果将谱带展宽效应降至最低，则可获得更窄的谱带，从而提高效率。这些更高、更窄的色谱峰更容易被检测器检测到，且由于分析物谱带更集中，因此具有更高的灵敏度和分离度。因此，在努力减少和控制这些影响，提高整体色谱性能时，认识到影响谱带展宽的因素是很重要的。

在色谱系统内，柱效应和柱外效应[色谱柱外的所有影响因素]都会影响谱带展宽。柱外效应的来源包括进样体积、样品进样器和色谱柱之间的仪器流路、从色谱柱出口到检测器[包括流通池]的流路以及其中包含的所有连接件。谱带展宽的柱效应来源包括填料粒径、柱内填料的填充情况及其与流动相流速、分析物大小和几何形状相关的扩散特性。每种因素的方差(σ2)总和影响着色谱峰的宽度[图8]。

为了显著提高液相色谱的性能，必须减少柱外效应和柱效应对谱带展宽的影响。ACQUITY UPLC系统基于减少两种形式的谱带展宽的理念，能够有效地改进效率和灵敏度[图9]。

解决柱外效应[仪器]谱带展宽

为了实现色谱性能的显著改进，我们开展了大量工程方面的工作，设计了一款可以承受小颗粒（亚2 µm）填料产生的压力的液相色谱仪器。同时尽量减少流路的扩散，从而达到柱分离的理论性能。同样重要的是，该仪器是适合常规实验室使用的可靠、耐用且精确的分析工具。为了证明仪器设计的重要性，需要了解系统扩散[仪器+色谱柱的谱带展宽]对色谱结果会产生什么样的影响。

塔板数[N]或柱效的测量需考虑色谱峰的扩散。峰宽与分析物谱带通过检测器时的宽度直接相关，而该峰的顶点是该谱带中分析物分子浓度最大的点。此测量在等度条件下进行。

推导出的塔板数方程如图10所示，其中[Vn]是峰的洗脱体积，[w]是峰宽，[a]是一个常数，该常数根据测量峰宽时的峰高确定。只要峰完全对称，每种测量峰宽的方法产生的塔板数结果就会相同。如果峰出现任何前沿或拖尾，这些测量方法产生的结果将会不同。

人们经常误以为塔板数只表示色谱柱本身的性能。然而，色谱柱和仪器导致的谱带展宽也会影响用于测定塔板数的峰宽。为了证明仪器本身对谱带展宽的影响，分别在两个不同的仪器上运行同一HPLC色谱柱：一个标准的HPLC[谱带展宽= 7.2 µL]和一个ACQUITY UPLC系统[谱带展宽= 2.8 µL]。由于在两个系统上运行的色谱柱相同，因此认为色谱柱的谱带展宽是常量。观察到ACQUITY UPLC系统的效率相对较高，这表明谱带展宽较小的仪器能够产生更窄的峰宽，从而获得更高的塔板数[图11]。

管长和直径的影响

样品谱带进入液流后，将被一同带入色谱柱中。ACQUITY UPLC样品管理器的设计目的是尽可能地缩短进样器和色谱柱进样口之间的距离，从而大幅减小谱带展宽。色谱柱将样品谱带分离为单个分析物谱带。随后，色谱分离后的分析物谱带将从色谱柱转移到检测器。初看之下，人们可能没有考虑到连接色谱柱出口和检测器进样口的管路内径[ID]的重要性。然而，内径对仪器的谱带展宽有着极大影响[图12]。

不出所料，谱带展宽会随着管路内径的减小而减小。高浓度分析物谱带通过一根大内径的管路后，该谱带的浓度将大幅下降，从而导致峰宽变宽、峰形扭曲以及灵敏度降低。此外，管壁的摩擦将导致与管壁接触的分析物分子比管中心的分子移动得慢，从而导致谱带的剖面扭曲。减小管路内径，分析物谱带中心和外缘之间的距离就能缩短，这能够减少谱带的畸变。减少管路的长度也十分重要，因为管路过长也会导致样品谱带扭曲。

检测器设置对柱外谱带展宽的影响

除了仪器基于流体的谱带展宽造成影响外，与采集速度和滤光器常数相关的数字检测器设置也会影响色谱结果。这些设置对于UPLC应用尤其重要，因为UPLC的峰宽通常非常窄[1–2秒宽]，并且分析时间可能非常短。当设置检测器的采集速度时，选用的采集速度应当能在色谱峰上采集足够的数据点，正确地表示色谱峰。将检测器速率设置得过高会对信噪比产生负面影响，导致基线噪音增加，而目标分析物的信号高度不会增加。相反，将检测器采集速率设置得太慢将导致整个色谱峰的数据点不足，从而降低观察到的色谱柱效，并会负面影响可重现定量分析的能力。此外，时间常数[数字滤光器]可以通过平滑数据点优化信噪比，可与采集速度结合使用，也可以单独使用。

随着分析物谱带的宽度变窄，检测器设置变得越来越重要。这要求采集速度不仅要快到足够以数字化方式创建色谱峰，还要正确呈现UPLC色谱柱中实现的高分离度的分离（如果存在紧密洗脱峰）。

流速较慢时，色谱峰在时间轴上的分布更分散，对设置的要求没有那么严格。然而，随着色谱峰变窄，分析速度加快[如UPLC分离]，必须保持采集速度和时间常数的设置合理[图13]。将UPLC技术用于“现实”应用时，明智的做法是选择能准确捕获最窄色谱峰峰形的检测器数据采集速率[Hz]，然后应用能为分析提供理想信噪比和分离度的滤光器时间常数[s]。