Leitfaden zur Flüssigchromatographie für Einsteiger

In Abbildung H werden drei Farbstoffverbindungen durch drei zeitlich getrennte Peaks im Chromatogramm dargestellt. Jeder eluiert an einer bestimmten Stelle, gemessen als Zeit zwischen dem Zeitpunkt der Injektion [Zeitpunkt Null] und dem Zeitpunkt, an dem das Peakmaximum eluiert. Durch Vergleich der Retentionszeit [t_R] jedes Peaks mit der Retentionszeit des injizierten Referenzstandards im selben chromatographischen System [gleiche mobile und stationäre Phase] kann ein Chromatograph jede Verbindung identifizieren.

In dem in Abbildung I-1 dargestellten Chromatogramm wusste der Chromatograph, dass der Analyt, Acrylamid, unter diesen LC-Systembedingungen bei 2,85 Minuten [Retentionszeit] von der Säule getrennt und eluiert wird. Jedes Mal, wenn eine neue Probe, die Acrylamid enthielt, unter den gleichen Bedingungen in das LC-System injiziert wurde, lag ein Peak bei 2,85 Minuten vor [siehe Probe B in Abbildung I-2].

[Um besser zu verstehen, warum sich einige Verbindungen langsamer bewegen [besser zurückgehalten werden] als andere, lesen Sie bitte die HPLC-Trennmodi].

Sobald die Identität festgestellt wurde, ist die nächste wichtige Information, welche Menge jeder Verbindung in der Probe vorhanden war. Das Chromatogramm und die zugehörigen Daten des Detektors helfen uns bei der Berechnung der Konzentration jeder Verbindung. Der Detektor reagiert im Wesentlichen auf die Konzentration der Verbindungsbande, wenn diese die Flusszelle passiert. Je konzentrierter diese ist, desto stärker ist das Signal; dies wird als eine höhere Peakhöhe über der Basislinie gesehen.

In Abbildung I-2 sind Chromatogramme für die Proben A und B auf derselben Zeitskala übereinander angeordnet. In beiden Läufen wurde das gleiche Probenvolumen injiziert. Beide Chromatogramme zeigen einen Peak bei einer Retentionszeit [t_R] von 2,85 Minuten, was darauf hinweist, dass jede Probe Acrylamid enthält. Probe A zeigt jedoch einen viel größeren Peak für Acrylamid. Die Fläche unter einem Peak [Peakflächenzahl] ist ein Maß für die Konzentration der Verbindung, die er darstellt. Dieser Flächenwert wird automatisch von der Computerdatenstation integriert und berechnet. In diesem Beispiel hat der Peak für Acrylamid in Probe A die zehnfache Fläche des Peaks von Probe B. Mithilfe von Referenzstandards kann bestimmt werden, dass Probe A 10 Pikogramm Acrylamid enthält, was dem Zehnfachen der Menge in Probe B entspricht [1 Pikogramm]. Beachten Sie, dass es in beiden Proben einen weiteren Peak [nicht identifiziert] gibt, der bei 1,8 Minuten eluiert. Da die Flächenangaben für diesen Peak in beiden Proben in etwa gleich sind, könnte diese unbekannte Verbindung in beiden Proben die gleiche Konzentration aufweisen.

Isokratischer und Gradientenbetrieb von LC-Systemen

In der HPLC gibt es grundsätzlich zwei Formen der Elution. Die erste wird als isokratische Elution bezeichnet. Bei dieser Form bleibt die mobile Phase, die entweder aus einem reinen Lösungsmittel oder einer Mischung besteht, über den gesamten Lauf unverändert. Ein typisches System ist in Abbildung J-1 dargestellt.

Die zweite Form wird Gradientenelution genannt. Dabei ändert sich, wie der Name schon sagt, die Zusammensetzung der mobilen Phase im Verlauf der Trennung. Diese Form ist besonders für Proben geeignet, die Verbindungen enthalten, die sich über einen weiten chromatographischen Polaritätsbereich erstrecken [siehe Abschnitt über HPLC-Trennmodi]. Die Elutionsstärke der mobilen Phase wird im Verlauf der Trennung erhöht, um stärker zurückgehaltene Bestandteile der Probe zu eluieren.

Im einfachsten Fall, wie in Abbildung J-2 dargestellt, kommen zwei Lösungsmittelflaschen und zwei Pumpen zum Einsatz. Die Geschwindigkeit jeder Pumpe wird vom Gradienten-Controller gesteuert. Er bestimmt, ob im Verlauf der Trennung mehr oder weniger des jeweiligen Lösungsmittels gepumpt werden soll. Die beiden Ströme werden in einem Mischer kombiniert, um die tatsächliche Zusammensetzung der mobilen Phase zu erzeugen, die im Laufe der Zeit zur Säule gefördert wird. Am Anfang enthält die mobile Phase einen höheren Anteil des schwächeren Lösungsmittels [Lösungsmittel A]. Im Laufe der Zeit wird der Anteil des stärkeren Lösungsmittels [Lösungsmittel B] nach einen vordefinierten Zeitplan erhöht. Beachten Sie, dass sich der Mischer in Abbildung J-2 hinter den Pumpen befindet; daher wird der Gradient unter hohem Druck erzeugt. Andere HPLC-Systeme sind so konstruiert, dass mehrere Lösungsmittelströme unter niedrigem Druck vor einer einzelnen Pumpe gemischt werden. Ein Gradienten-Mischventil wird von den vier Lösungsmittelflaschen gespeist und ändert so die Stärke der mobilen Phase im Laufe der Zeit [siehe Abbildung J-3].

HPLC-Maßstab [Analytisch, Präparativ und Prozessierung]

Wir haben besprochen, wie die HPLC analytische Daten liefert, die sowohl zur Identifizierung als auch zur Quantifizierung von in einer Probe vorhandenen Verbindungen verwendet werden können. Die HPLC kann jedoch auch verwendet werden, um gewünschte Mengen jeder Verbindung zu reinigen und zu sammeln, wobei ein Fraktionssammler nach der Flusszelle des Detektors verwendet wird. Dieser Vorgang wird präparative Chromatographie genannt [siehe Abbildung K].

Bei der präparativen Chromatographie ist der Wissenschaftler in der Lage, die einzelnen Analyten bei der Elution von der Säule zu sammeln [wie in diesem Beispiel: gelb, dann rot, dann blau].

Der Fraktionssammler fängt über einen festgelegten Zeitraum selektiv das Eluat auf, das jetzt einen gereinigten Analyten enthält. Die Gefäße werden so bewegt, dass jedes nur einen einzelnen Analytpeak sammelt.

Ein Wissenschaftler legt Ziele für den Reinheitsgrad und die Menge fest. Gepaart mit der Kenntnis der Komplexität der Probe sowie der Art und Konzentration der gewünschten Analyten in Bezug auf die Matrixbestandteile, bestimmen diese Ziele wiederum die zu prozessierende Probenmenge und die erforderliche Kapazität des HPLC-Systems. Im Allgemeinen wird die HPLC-Säule mit zunehmender Probengröße größer und die Pumpe benötigt eine höhere Volumenflussrate. Die Bestimmung der Kapazität eines HPLC-Systems wird als Auswahl des HPLC-Maßstabs bezeichnet. Tabelle A listet verschiedene HPLC-Maßstäbe und ihre chromatographischen Ziele auf.

Die Möglichkeit, die Selektivität mit einer spezifischen Kombination aus stationärer und mobiler HPLC-Phase zu maximieren, d. h. die größtmögliche Trennung zwischen zwei interessierenden Probenkomponenten zu erreichen, ist entscheidend für die Festlegung der Anforderungen für die Skalierung einer Trennung [siehe Diskussion über HPLC-Trennungsmodi]. Die Kapazität ist dann eine Frage der Skalierung des Säulenvolumens [V_c] auf die zu injizierende Probenmenge und der Auswahl einer geeigneten Partikelgröße [bestimmt Druck und Effizienz; siehe Erörterung des Trennvermögens]. Das Säulenvolumen, eine Funktion der Bettlänge [L] und des Innendurchmessers [i.d.], bestimmt die Menge an Packungsmaterial [Partikeln], die enthalten sein kann (siehe Abbildung L).

Im Allgemeinen haben HPLC-Säulen eine Länge [L] von 20 mm bis 500 mm und einen Innendurchmesser [i.d.] von 1 mm bis 100 mm. Mit zunehmendem Maßstab der Chromatographie nehmen auch die Säulendimensionen, insbesondere die Querschnittsfläche, zu. Um den Durchsatz zu optimieren, müssen die Flussraten der mobilen Phase proportional zur Querschnittsfläche zunehmen. Wenn eine kleinere Partikelgröße für mehr Trennleistung erwünscht ist, müssen die Pumpen so konstruiert sein, dass sie höhere Volumenflussraten der mobilen Phase bei hohem Rückdruck aufrechterhalten. Tabelle B enthält einige einfache Richtlinien zur Auswahl des für jeden Chromatographiemaßstab empfohlenen Säuleninnendurchmessers und Partikelgrößenbereichs.

Zum Beispiel würde eine Applikation im halbpräparativen Maßstab [rotes X] eine Säule mit einem Innendurchmesser von 10 bis 40 mm verwenden, die 5 bis 15 Mikrometer Partikel enthält. Die Säulenlänge könnte dann basierend darauf berechnet werden, wie viel gereinigte Verbindung während jedes Laufs verarbeitet werden muss und wie viel Trennleistung erforderlich ist.