Leitfaden zur Flüssigchromatographie für Einsteiger

Im Allgemeinen können drei Haupteigenschaften chemischer Verbindungen zur HPLC-Trennung verwendet werden. Diese sind:

• Polarität
• Elektrische Ladung
• Molekulare Größe

Betrachten wir zunächst die Polarität und die beiden primären Trennmodi, die diese Eigenschaft ausnutzen: Normalphasen- und Umkehrphasenchromatographie.

Trennungen basierend auf der Polarität

Struktur, Aktivität und physikalisch-chemische Eigenschaften eines Moleküls werden durch die Anordnung seiner Atome und die Bindungen zwischen ihnen bestimmt. Innerhalb eines Moleküls wird eine spezifische Anordnung bestimmter Atome, die für besondere Eigenschaften und vorhersehbare chemische Reaktionen verantwortlich ist, funktionelle Gruppe genannt. Diese Struktur bestimmt oft, ob das Molekül polar oder unpolar ist. Organische Moleküle werden gemäß der jeweils enthaltenen funktionellen Hauptgruppe(n) in Klassen eingeteilt. Bei Verwendung eines auf der Polarität basierenden Trennmodus wird die relative chromatographische Retention verschiedener Arten von Molekülen weitgehend durch die Art und Position dieser funktionellen Gruppen bestimmt. Wie in Abbildung P gezeigt, können Molekülklassen durch ihre relative Retention in einem Bereich oder Spektrum der chromatographischen Polarität von hochpolar bis hochgradig unpolar geordnet werden.

Wasser [ein kleines Molekül mit hohem Dipolmoment] ist eine polare Verbindung. Benzol [ein aromatischer Kohlenwasserstoff] ist eine unpolare Verbindung. Moleküle mit ähnlicher chromatographischer Polarität neigen dazu, voneinander angezogen zu werden; solche mit unterschiedlicher Polarität zeigen, wenn überhaupt, eine viel schwächere Anziehungskraft und können einander sogar abstoßen. Dies bildet die Grundlage für chromatographische Trennverfahren auf der Grundlage der Polarität.

Man kann sich dies auch durch die bekannte Analogie vorstellen: Öl [unpolar] und Wasser [polar] mischen sich nicht. Im Gegensatz zum Magnetismus, bei dem entgegengesetzte Pole einander anziehen, hängen chromatographische Trennungen auf Basis der Polarität von der stärkeren Anziehungskraft zwischen Gleichen und der schwächeren Anziehung zwischen Gegenpolen ab. Denken Sie daran, dass bei der polaritätsbasierten Chromatographie „Gleiches das Gleiche anzieht“.

Um ein chromatographisches Trennsystem zu entwickeln [siehe Abbildung Q], erzeugen wir Konkurrenz um die verschiedenen in der Probe enthaltenen Verbindungen, indem wir eine mobile Phase und eine stationäre Phase mit unterschiedlichen Polaritäten auswählen. Verbindungen in der Probe werden verzögert, die eine ähnliche Polarität wie die stationäre Phase [Säulenpackungsmaterial] haben, da sie von den Partikeln stärker angezogen werden. Verbindungen, deren Polarität der Polarität der mobilen Phase ähnelt, werden bevorzugt von dieser angezogen und bewegen sich schneller.

Auf diese Weise wird basierend auf den Unterschieden in der relativen Anziehungskraft jeder Verbindung für jede Phase eine Trennung durch Änderung der Geschwindigkeiten der Analyten erzeugt.

Die Abbildungen R-1, R-2 und R-3 zeigen typische chromatographische Polaritätsbereiche für mobile Phasen, stationäre Phasen bzw. Probenanalyte. Betrachten wir beide Phasen der Reihe nach, um zu sehen, wie ein Chromatograph die geeigneten Phasen auswählt, um die Anziehungskonkurrenz zu entwickeln, die für eine polaritätsbasierte HPLC-Trennung erforderlich ist.

Eine Skala, wie die in Abbildung R-1 gezeigte, auf der einige gebräuchliche Lösungsmittel in der Reihenfolge ihrer relativen chromatographischen Polarität angeordnet sind, wird als eluotrope Reihe bezeichnet. Moleküle der mobilen Phase, die effektiv mit Analytmolekülen um die anziehenden Stellen der stationären Phase konkurrieren, verdrängen diese Analyten, wodurch sie sich schneller durch die Säule bewegen [schwach zurückgehalten]. Wasser ist am polaren Ende der Lösungsmittelskala der mobilen Phase, während Hexan, ein aliphatischer Kohlenwasserstoff, am unpolaren Ende liegt. Dazwischen können einzelne Lösungsmittel sowie Gemische mischbarer Lösungsmittel [gemischt in geeigneten Verhältnissen, um die spezifischen Trennanforderungen zu erfüllen] in der Reihenfolge ihrer Elutionsstärke angeordnet werden. Welches Ende der Skala die „stärkste“ mobile Phase darstellt, hängt von der Art der Oberfläche der stationären Phase ab, auf der die Konkurrenz um die Analytmoleküle stattfindet.

Silika hat eine aktive, hydrophile [wasserliebende] Oberfläche, die funktionelle Silanolgruppen [siliziumhaltiges Analogon von Alkohol] enthält. Folglich liegt sie am polaren Ende der in Abbildung R-2 gezeigten Skala der stationären Phase. Die Aktivität oder Polarität der Siliciumdioxidoberfläche kann selektiv verändert werden, indem weniger polare funktionelle Gruppen chemisch an sie gebunden werden [gebundene Phase]. Die hier gezeigten Beispiele sind, nach abnehmender Polarität geordnet, Cyanopropylsilyl- [CN]-, n-Octylsilyl- [C₈]- und n-Octadecylsilyl- [C₁₈, ODS]-Einheiten auf Silika. Letztere ist eine hydrophobe [nicht in Wasser lösliche], sehr unpolare Packung.

Abbildung R-3 wiederholt das chromatographische Polaritätsspektrum unserer Probe [gezeigt in Abbildung P]. Nach Abwägen der Polarität beider Phasen muss ein Chromatograph für eine gegebene stationäre Phase eine mobile Phase auswählen, in der die interessierenden Analyten zurückgehalten werden, jedoch nicht so stark, dass sie nicht eluiert werden können. Bei Lösungsmitteln ähnlicher Stärke muss der Chromatograph abwägen, welche Phasenkombination die feineren Unterschiede in der Polarität und Löslichkeit des Analyten am besten ausnutzen kann, um die Selektivität des chromatographischen Systems zu maximieren. Gleiches zieht Gleiches an, aber wie Sie sich wahrscheinlich aus den bisherigen Diskussionen vorstellen können, erfordert die Erstellung einer Trennung auf Basis der Polarität die Kenntnis der Probe und Erfahrung mit verschiedenen Arten von Analyten und Retentionsmodi. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Chromatograph die beste Kombination aus einer mobilen Phase und einer stationären Partikelphase mit entsprechend entgegengesetzten Polaritäten wählt. Wenn sich dann die Probenanalyten durch die Säule bewegen, wird nach der Regel Gleiches zieht Gleiches an bestimmt, welche Analyten langsamer und welche schneller werden.

Normalphasen-HPLC

Bei seinen Trennungen von Pflanzenextrakten verwendete Tswett erfolgreich eine polare stationäre Phase [Kreide in einer Glassäule; siehe Abbildung A] mit einer viel weniger polaren [unpolaren] mobilen Phase. Dieser klassische Chromatographiemodus wurde als Normalphase bekannt.

Abbildung S-1 zeigt eine chromatographische Normalphasentrennung unseres Drei-Farben-Testgemischs. Die stationäre Phase ist polar und hält den polaren gelben Farbstoff am stärksten zurück. Der relativ unpolare blaue Farbstoff gewinnt im Retentionswettbewerb durch die mobile Phase, ein unpolares Lösungsmittel, und eluiert schnell. Da der blaue Farbstoff der mobilen Phase am ähnlichsten ist [beide sind unpolar], bewegt er sich schneller. Es ist typisch für die Normalphasenchromatographie an Silika, dass die mobile Phase zu 100 % aus organischem Material besteht; es wird kein Wasser verwendet.

Umkehrphasen-HPLC

Der Begriff „Umkehrphase“ beschreibt den Chromatographiemodus, der genau das Gegenteil einer Normalphase ist, nämlich die Verwendung einer polaren mobilen Phase und einer unpolaren [hydrophoben] stationären Phase. Abbildung S-2 zeigt das schwarze Gemisch aus drei Farbstoffen, das mit einem solchen Protokoll getrennt wird.

Jetzt ist die am stärksten zurückgehaltene Verbindung der weniger polare blaue Farbstoff, da seine Anziehungskraft auf die unpolare stationäre Phase am größten ist. Der polare gelbe Farbstoff, der schwach zurückgehalten wird, gewinnt in Konkurrenz von der polaren, wässrigen mobilen Phase, da er sich am schnellsten durch das Bett bewegt und am frühesten eluiert, denn Gleiches zieht Gleiches an.

Heute wird die Umkehrphasenchromatographie wegen ihrer besseren Reproduzierbarkeit und ihrer breiten Anwendbarkeit für ca. 75 % aller HPLC-Methoden eingesetzt. Die meisten dieser Protokolle verwenden als mobile Phase ein wässriges Gemisch aus Wasser mit einem mischbaren, polaren organischen Lösungsmittel wie Acetonitril oder Methanol. Dies stellt normalerweise die korrekte Wechselwirkung der Analyten mit der unpolaren, hydrophoben Partikeloberfläche sicher. Ein C₁₈-gebundenes Silika [manchmal ODS genannt] ist der gebräuchlichste Typ von Umkehrphasen-HPLC-Packungen.

Tabelle C enthält eine Zusammenfassung der Phaseneigenschaften für die zwei wichtigsten HPLC-Trennmodi, basierend auf der Polarität. Denken Sie daran, dass bei diesen polaritätsbasierten Modi gilt: Gleiches zieht Gleiches an.

Hydrophile Interaktionschromatographie [HILIC]

HILIC kann als eine Variante der Normalphasenchromatographie betrachtet werden. Bei der Normalphasenchromatographie ist die mobile Phase zu 100 % organisch. In der mobilen Phase und in den Poren der polaren Packungspartikel sind nur Spuren von Wasser vorhanden. Polare Analyten binden stark an die polare stationäre Phase und eluieren möglicherweise nicht.

Durch die Zugabe von etwas Wasser [< 20 %] zur organischen mobilen Phase [üblicherweise ein aprotisches Lösungsmittel wie Acetonitril] können polare Verbindungen, die im Normalphasenmodus stark [oder im Umkehrphasenmodus schwach] zurückgehalten werden, abgetrennt und eluiert werden. Wasser, ein sehr polares Lösungsmittel, konkurriert effektiv mit polaren Analyten um die stationäre Phase. HILIC kann im isokratischen Modus oder im Gradientenelutionsmodus betrieben werden. Polare Verbindungen, die anfänglich von den polaren Partikeln des Packungsmaterials angezogen werden, können eluiert werden, wenn die Polarität [Stärke] der mobilen Phase erhöht wird [durch Hinzufügen von mehr Wasser]. Analyte werden in der Reihenfolge steigender Hydrophilie [chromatographische Polarität in Bezug auf Wasser] eluiert. Der mobilen Phase können Puffer oder Salze zugesetzt werden, um ionisierbare Analyten in einer einzigen Form zu halten.

Hydrophobe Interaktionschromatographie [HIC]

Die HIC ist eine Art der Umkehrphasenchromatographie, die zur Trennung großer Biomoleküle wie Proteine verwendet wird. Es ist in der Regel wünschenswert, diese Moleküle in einer wässrigen Lösung intakt zu halten, um den Kontakt mit organischen Lösungsmitteln oder Oberflächen zu vermeiden, die sie denaturieren könnten. Die HIC nutzt die hydrophobe Wechselwirkung großer Moleküle mit einer mäßig hydrophoben stationären Phase, z. B. butylgebundenem [C₄] anstelle von octadecylgebundenem [C₁₈] Silika. Höhere Salzkonzentrationen im Wasser führen zunächst dazu, dass die Proteine auf der Packung zurückgehalten [ausgesalzen] werden. Gradiententrennungen werden in der Regel durch Verringern der Salzkonzentration durchgeführt. Auf diese Weise werden Biomoleküle in der Reihenfolge ihrer zunehmenden Hydrophobizität eluiert.

Trennungen basierend auf der Ladung: Ionenaustauschchromatographie [IEC]

Bei Trennungen auf Basis der Polarität wird Gleiches von Gleichem angezogen und Gegensätze können abgestoßen werden. Bei der Ionenaustauschchromatographie und anderen Trennungen, die auf elektrischer Ladung beruhen, ist die Regel umgekehrt. Gleiches kann sich abstoßen, während Gegensätze einander anziehen. Stationäre Phasen für Trennungen mit Ionenaustauschern werden durch die Art und Stärke der sauren oder basischen Funktionen auf ihrer Oberfläche und die Art der Ionen, die sie anziehen und zurückhalten, charakterisiert. Der Kationenaustausch wird verwendet, um positiv geladene Ionen auf einer negativen Oberfläche zurückzuhalten und zu trennen. Umgekehrt wird der Anionenaustausch verwendet, um negativ geladene Ionen auf einer positiven Oberfläche zurückzuhalten und zu trennen [siehe Abbildung T]. Bei jeder Art des Ionenaustauschs gibt es mindestens zwei allgemeine Ansätze zur Trennung und Elution.

Starke Ionenaustauscher tragen funktionelle Gruppen [z. B. quaternäre Amine oder Sulfonsäuren], die immer ionisiert sind. Sie werden normalerweise verwendet, um schwache Ionen zurückzuhalten und zu trennen. Diese schwachen Ionen können durch Verdrängung mit einer mobilen Phase eluiert werden, die Ionen enthält, die stärker von der stationären Phase angezogen werden. Alternativ können schwache Ionen auf der Säule zurückgehalten und dann neutralisiert werden (durch in-situ-Änderung des pH-Werts der mobilen Phase), wodurch sie ihre Anziehungskraft verlieren und eluieren.

Schwache Ionenaustauscher [z. B. mit sekundären Amin- oder Carbonsäurefunktionen] können oberhalb oder unterhalb eines bestimmten pH-Werts neutralisiert werden und verlieren ihre Fähigkeit, Ionen durch Ladung zurückzuhalten. Wenn sie geladen sind, werden sie verwendet, um starke Ionen zurückzuhalten und zu trennen. Wenn diese Ionen nicht durch Verdrängung eluiert werden können, können die stationären Phasenaustauschstellen neutralisiert werden, wodurch die Ionenanziehung abgeschaltet wird und die Elution der geladenen Analyten ermöglicht wird.

Wenn schwache Ionenaustauscher neutralisiert werden, können sie Spezies durch hydrophobe [Umkehrphase] oder hydrophile [Normalphasen] Wechselwirkungen zurückhalten und trennen; in diesen Fällen wird die Elutionsstärke durch die Polarität der mobilen Phase bestimmt [Abbildung R-1]. Daher können schwache Ionenaustauscher für Mixed-Mode-Trennungen verwendet werden [Trennungen basieren sowohl auf Polarität als auch auf Ladung].

Tabelle D enthält Richtlinien für die Hauptkategorien des Ionenaustauschs. Um zum Beispiel einen stark basischen Analyten [immer positiv geladen] zurückzuhalten, verwenden Sie einen schwachen Kationenaustauscher-Partikel der stationären Phase bei einem pH-Wert > 7; dies gewährleistet eine negativ geladene Partikeloberfläche. Um die starke Base freizusetzen oder zu eluieren, senken Sie den pH-Wert der mobilen Phase auf unter 3; dadurch wird die Oberflächenladung entfernt und der Ionenaustausch-Retentionsmechanismus abgeschaltet.

Beachten Sie, dass ein pK_a der pH-Wert ist, bei dem 50 % der funktionellen Gruppe ionisiert und 50 % neutral sind. Um einen im Wesentlichen neutralen oder eine vollständig geladene Analyt- oder Partikeloberfläche zu gewährleisten, muss der pH-Wert auf einen Wert eingestellt werden, der mindestens 2 Einheiten über dem pK_a-Wert liegt [in Tabelle D angegeben].

Verwenden Sie keinen starken Kationenaustauscher, um eine starke Base aufrechtzuerhalten; beide bleiben geladen und ziehen sich stark an, was eine Elution der Base nahezu unmöglich macht. Sie kann nur entfernt werden, indem der starke Kationenaustauscher mit einer konkurrierenden Base überlagert wird, die eine noch stärkere Retention zeigt und die interessierende Verbindung verdrängt, indem sie die Konkurrenz um die aktiven Austauschstellen gewinnt. Dieser Ansatz ist bei HPLC und SPE selten praktisch oder sicher. [Die Arbeit mit sehr starken Säuren und Basen ist gefährlich und sie können die Konstruktionsmaterialien von HPLC-Flüssigkeitssystemen angreifen!]

Trennungen auf Basis der Größe: Größenausschlusschromatographie [SEC] – Gelpermeationschromatographie [GPC]

In den 1950er Jahren entdeckten Porath und Flodin, dass Biomoleküle anhand ihrer Größe statt anhand ihrer Ladung oder Polarität getrennt werden können, indem sie durch ein hydrophiles Dextranpolymer mit kontrollierter Porosität geleitet bzw. gefiltert werden. Dieser Vorgang wurde als Gelfiltration bezeichnet. Später wurde ein analoges Schema verwendet, um synthetische Oligomere und Polymere mithilfe organischer Polymerfüllungen mit spezifischen Porengrößen zu trennen. Dieser Vorgang wurde Gelpermeationschromatographie [GPC] genannt. Ähnliche Trennungen, die unter Verwendung von Silika-Packungen mit kontrollierter Porosität durchgeführt wurden, wurden Größenausschlusschromatographie [SEC] genannt. Die ersten kommerziellen HPLC-Geräte wurden 1963 auf den Markt gebracht und für GPC-Applikationen entwickelt [siehe Referenz 3].

Alle diese Techniken werden in der Regel an stationären Phasen durchgeführt, die mit einer Verteilung der Porengrößen in einem Bereich synthetisiert wurden, der es den interessierenden Analyten ermöglicht, in einen größeren oder kleineren Teil des Porenvolumens der Packung einzudringen bzw. daraus ausgeschlossen zu werden. Kleinere Moleküle dringen bei ihrem Durchgang durch das Bett in mehr Poren ein. Größere Moleküle können nur ab einer bestimmten Größe in Poren eindringen, sodass sie weniger Zeit im Bett verbringen. Die größten Moleküle können vollständig aus den Poren ausgeschlossen werden und gelangen nur zwischen die Partikel, wobei sie in einem kleinen Volumen sehr schnell eluieren. Mobile Phasen werden aus zwei Gründen ausgewählt: Zum einen sind sie gute Lösungsmittel für die Analyten; zum anderen können sie jegliche Wechselwirkungen [basierend auf Polarität oder Ladung] zwischen den Analyten und der Oberfläche der stationären Phase verhindern. Auf diese Weise eluieren die größeren Moleküle zuerst, während sich die kleineren Moleküle langsamer bewegen [weil sie sich in die Poren hinein- und wieder herausbewegen] und später in absteigender Reihenfolge ihrer Größe in der Lösung eluieren. Daher die einfache Regel: Die Großen kommen zuerst.

Da es möglich ist, das Molekulargewicht eines Polymers mit seiner Größe in Lösung zu korrelieren, hat die GPC die Messung der Molekulargewichtsverteilung von Polymeren revolutioniert, die wiederum die physikalischen Eigenschaften bestimmt, die die Verarbeitung, Qualität und Leistung von Polymeren verbessern oder beeinträchtigen können [wie man gute von schlechten Polymeren unterscheidet].

Zusammenfassung

Wir hoffen, dass Ihnen diese kurze Einführung in die HPLC gefallen hat. Wir empfehlen Ihnen, die Literaturhinweise und den Anhang zur HPLC-Nomenklatur zu lesen.