Leitfaden zur Flüssigchromatographie für Einsteiger

Ein Säulenrohr und die dazugehörigen Fittings müssen das chromatographische Packungsmaterial [stationäre Phase] enthalten, das für die Trennung verwendet wird. Diese müssen dem bei der Herstellung und im Betrieb erzeugten Rückdruck standhalten. Außerdem muss das Säulenrohr einen gut kontrollierten [leckfreien, minimalvolumigen und totraumfreien] Flussweg für die Probe am Einlass und die Analytbanden am Auslass bieten und gegenüber dem Trennsystem [Probe, mobile und stationäre Phasen] chemisch inert sein. Die meisten Säulen sind aus Edelstahl gefertigt, um höchste Druckbeständigkeit zu gewährleisten. PEEK [ein technischer Kunststoff] und Glas sind zwar weniger druckbeständig, können aber verwendet werden, wenn inerte Oberflächen für spezielle chemische oder biologische Applikationen erforderlich sind. [Abbildung M-1].

Eine Säulenwand aus Glas bietet einen optischen Vorteil. Auf dem Foto in Abbildung M-2 wurde der Fluss angehalten, während sich die Probenbanden noch in der Säule befinden. Sie können sehen, dass sich die drei Farbstoffe in der injizierten Probenmischung bereits im Bett getrennt haben; der gelbe Analyt, der sich am schnellsten bewegt, verlässt die Säule gerade.

Trennleistung – Auflösung

Der Grad der Trennung zweier Verbindungen wird chromatographische Auflösung [RS] genannt. Zwei Hauptfaktoren, die die Gesamttrennleistung oder Auflösung bestimmen, die mit einer HPLC-Säule erreicht werden kann, sind: die mechanische Trennleistung, die durch die Säulenlänge, Partikelgröße und Gleichförmigkeit des Packungsbetts erzeugt wird, und die chemische Trennleistung, die durch die physikalisch-chemische Konkurrenz auf Verbindungen zwischen Packungsmaterial und mobiler Phase verursacht wird. Die Effizienz ist ein Maß für die mechanische Trennleistung, die Selektivität ist ein Maß für die chemische Trennleistung.

Mechanische Trennleistung – Effizienz

Wenn ein Säulenbett stabil und gleichmäßig gepackt ist, wird seine mechanische Trennleistung durch die Säulenlänge und die Partikelgröße bestimmt. Die mechanische Trennleistung, auch Effizienz genannt, wird häufig anhand der Plattenzahl [Symbol = N] gemessen und verglichen. Chromatographiebetten mit kleineren Partikeln haben eine höhere Effizienz und einen höheren Rückdruck. Bei einer gegebenen Partikelgröße wird mehr mechanische Trennleistung durch eine Vergrößerung der Säulenlänge erzielt. Dies führt jedoch zu längeren chromatographischen Laufzeiten, einem höheren Lösungsmittelverbrauch und einem höheren Rückdruck. Kürzere Säulenlängen minimieren all diese Variablen, verringern aber auch die mechanische Trennleistung, wie in Abbildung N gezeigt.

Für eine gegebene Partikelchemie, mobile Phase und Flussrate, wie in Abbildung O gezeigt, liefert eine Säule der gleichen Länge und des gleichen Innendurchmessers, aber mit einer kleineren Partikelgröße, mehr mechanische Trennleistung zur gleichen Zeit. Der Rückdruck ist jedoch viel höher.

Chemische Trennleistung – Selektivität

Die Wahl einer Kombination aus Partikelchemie [stationärer Phase] und Zusammensetzung der mobilen Phase – dem Trennsystem – bestimmt den Grad der chemischen Trennleistung [Änderung der Geschwindigkeit jedes Analyten]. Die Optimierung der Selektivität ist das wirksamste Mittel, um eine Trennung herbeizuführen; dies kann die Notwendigkeit der rohen Gewalt einer höchstmöglichen mechanischen Effizienz überflüssig machen. Um eine Trennung von zwei beliebigen festgelegten Verbindungen zu erreichen, kann ein Wissenschaftler aus einer Vielzahl von Phasenkombinationen [stationäre Phase und mobile Phase] und Retentionsmechanismen [Methoden der Chromatographie] auswählen. Diese werden im nächsten Abschnitt besprochen.