Initiation à la chromatographie en phase liquide (LC)

Sur la figure H, trois composés de colorants sont représentés par trois pics séparés dans le temps dans le chromatogramme. Chacun est élué en un emplacement spécifique, mesuré par le temps écoulé entre le moment de l’injection (instant zéro) et l’élution du maximum de pic. En comparant le temps de rétention (t_R) de chaque pic avec celui des étalons de référence injectés dans le même système chromatographique (mêmes phases mobile et stationnaire), un chromatographiste peut être en mesure d’identifier chaque composé.

Dans le chromatogramme de la figure I-1, le chromatographiste savait que, dans ces conditions de LC, l’analyte (l’acrylamide) serait séparé et élué de la colonne à 2,85 minutes (temps de rétention). Chaque fois qu’un nouvel échantillon contenant de l’acrylamide était injecté dans le système LC dans les mêmes conditions, un pic était présent à 2,85 minutes (voir l’échantillon B sur la figure I-2).

(Pour mieux comprendre pourquoi certains composés se déplacent plus lentement [sont mieux retenus] que d’autres, consultez la rubrique Modes de séparation HPLC.)

Une fois l’identité établie, il importe de déterminer la quantité de chaque composé présente dans l’échantillon. Le chromatogramme et les données associées du détecteur aident à calculer la concentration de chaque composé. En bref, le détecteur réagit à la concentration de la bande de composé lors de son passage dans la cellule de détection. Plus elle est concentrée, plus le signal est fort : il en résulte une hauteur de pic plus importante au-dessus de la ligne de base.

Sur la figure I-2, les chromatogrammes des échantillons A et B, sur la même échelle de temps, sont placés l’un au-dessus de l’autre. Le même volume d’échantillon a été injecté dans les deux analyses. Les deux chromatogrammes présentent un pic à un temps de rétention (t_R) de 2,85 minutes, indiquant que chaque échantillon contient de l’acrylamide. Cependant, l’échantillon A présente un pic beaucoup plus haut pour l’acrylamide. L’aire sous un pic (surface de pic) constitue une mesure de la concentration du composé qu’il représente. La valeur de cette surface est intégrée et calculée automatiquement par la station de données informatiques. Dans cet exemple, la surface du pic de l’acrylamide de l’échantillon A est 10 fois plus grande que celle de l’échantillon B. À l’aide d’étalons de référence, il est possible de déterminer que l’échantillon A contient 10 picogrammes d’acrylamide, soit dix fois plus que l’échantillon B (1 picogramme). Notez la présence d’un autre pic (non identifié) élué à 1,8 minute dans les deux échantillons. Les surfaces de pic étant à peu près identiques dans les deux échantillons, ce composé inconnu peut y être présent dans la même concentration.

Fonctionnement du système LC en modes isocratique et par gradient

La technologie HPLC emploie deux principaux modes d’élution. La première est appelée « élution isocratique ». Dans ce cadre, la composition de la phase mobile, qui peut être un solvant pur ou un mélange, reste constante pendant la totalité de l’analyse. La figure J-1 illustre un système classique.

Le second type est appelé « élution par gradient ». Comme son nom l’indique, la composition de la phase mobile change pendant la séparation. Ce mode s’adapte particulièrement aux échantillons contenant une vaste gamme de composés de polarités différentes (voir la section sur les modes de séparation HPLC). Au fur et à mesure de la séparation, le pouvoir éluant de la phase mobile augmente pour éluer les composés les plus fortement retenus par la colonne.

Dans le cas le plus simple, illustré à la figure J-2, le système comprend deux flacons de solvants et deux pompes. La vitesse de chacune des pompes est régulée par le contrôleur de gradient. Ainsi, le système délivre une quantité plus ou moins importante de chacun des solvants au cours de la séparation. Un mélangeur combine les deux flux de solvant pour obtenir la composition de phase mobile qui sera effectivement délivrée dans la colonne. Au début, la phase mobile contient une proportion plus importante du solvant le plus faible (le solvant A). Au fur et à mesure de la séparation, la proportion du solvant le plus fort (le solvant B) augmente suivant un programme défini à l’avance. Notez que sur la figure J-2, le mélangeur est en aval des pompes ; ainsi, le gradient est créé sous haute pression. D’autres systèmes HPLC mélangent plusieurs flux de solvants à basse pression, en amont d’une pompe unique. Une vanne proportionnante du gradient gère les flux arrivant des quatre flacons de solvant, ce qui modifie la force de la phase mobile au cours de la séparation (voir la figure J-3).

Échelle HPLC (analytique, préparative et procédé)

Nous avons expliqué comment la technologie HPLC fournit des données analytiques pouvant être utilisées à la fois pour identifier et quantifier les composés présents dans un échantillon. Cependant, elle peut également être utilisée pour purifier et recueillir les quantités souhaitées de chaque composé, à l’aide d’un collecteur de fractions en aval de la cellule de détection du détecteur. Ce procédé est appelé « chromatographie préparative » (voir la figure K).

En chromatographie préparative, le scientifique peut prélever les analytes individuels au fur et à mesure qu’ils éluent de la colonne (par exemple, ici : jaune, puis rouge, puis bleu).

Le collecteur de fractions recueille sélectivement l’éluat qui contient à présent un analyte purifié, pendant une durée spécifiée. Les récipients sont déplacés de sorte que chacun ne recueille qu’un seul pic d’analyte.

Un scientifique détermine les objectifs en termes de pureté et de quantité. Associés aux données sur la complexité de l’échantillon ainsi que sur la nature et la concentration des analytes souhaités par rapport à celles des constituants de la matrice, ces objectifs déterminent à leur tour la quantité d’échantillon à traiter et la capacité requise du système HPLC. En général, plus la taille de l’échantillon augmente, plus la taille de la colonne HPLC augmente et plus la pompe nécessite un débit élevé. La détermination de la capacité d’un système HPLC s’appelle la sélection de l’échelle HPLC. Le tableau A répertorie différentes échelles HPLC et leurs objectifs chromatographiques.

La capacité à maximiser la sélectivité grâce à une combinaison spécifique de phases stationnaire et mobile HPLC, en vue d’obtenir la plus grande séparation possible entre deux composés d’intérêt de l’échantillon, est essentielle pour déterminer les exigences afin d’augmenter l’échelle d’une séparation (voir la discussion sur les modes de séparation HPLC). La capacité devient alors une question d’adaptation du volume de la colonne (V_c) en fonction de la quantité d’échantillon à injecter et de sélection de la granulométrie appropriée (qui détermine la pression et l’efficacité ; voir la discussion sur le pouvoir de séparation). Le volume de la colonne, fonction de la longueur du lit (L) et du diamètre interne (i.d.), détermine la quantité de matériau de remplissage (particules) qui peut être contenue (voir la figure L).

En général, les colonnes HPLC mesurent de 20 à 500 mm de long (L) et de 1 à 100 mm de diamètre interne (i.d.). Plus l’échelle de la chromatographie augmente, plus les dimensions de la colonne, en particulier la surface transversale, augmentent également. Pour optimiser la vitesse d’analyse, les débits de phase mobile doivent augmenter proportionnellement à la surface transversale. Si une granulométrie inférieure est souhaitable pour obtenir un pouvoir de séparation supérieur, les pompes doivent alors être conçues pour supporter des débits de phase mobile plus élevés à une pression élevée. Le tableau B présente quelques directives simples pour la sélection du diamètre interne de la colonne ainsi que la plage granulométrique recommandée pour chaque échelle chromatographique.

Par exemple, une application à l’échelle semi-préparative (croix rouge) nécessiterait une colonne d’un diamètre interne de 10 à 40 mm contenant des particules de 5 à 15 µm. La longueur de colonne peut ensuite être calculée en fonction de la quantité de composé purifié à traiter à chaque analyse et du pouvoir de séparation nécessaire.