Initiation à la chromatographie en phase liquide (LC)

Les composants d’un système de chromatographie liquide haute performance (HPLC) de base sont représentés de manière simplifiée à la figure E.

Un réservoir contient le solvant (appelé phase mobile, car il se déplace). Une pompe haute pression (système de pompage de solvant ou module de pompe) est utilisée pour générer et mesurer un débit spécifique de phase mobile, généralement en millilitres par minute. Un injecteur (module d’injection ou passeur d’échantillons) permet d’introduire (injecter) l’échantillon dans le flux continu de phase mobile qui amène l’échantillon dans la colonne HPLC. La colonne contient le matériau de remplissage chromatographique nécessaire à la séparation. Ce matériau de remplissage est appelé « phase stationnaire », car il est maintenu en place par le matériel de la colonne. Un détecteur est nécessaire pour repérer les bandes des composés séparés lorsqu’ils éluent de la colonne HPLC, car la plupart des composés sont incolores et ne sont donc pas visibles à l’œil nu. La phase mobile sort alors du détecteur et peut être évacuée en tant que déchet ou recueillie, au choix. Lorsque la phase mobile contient une bande de composé séparé, le système HPLC permet de récupérer cette fraction de l’éluat contenant ce composé purifié en vue d’une étude plus approfondie. C’est ce qu’on appelle la « chromatographie préparative » (qui sera abordée dans la section relative à l’échelle HPLC).

Notez que des tubulures et des raccords haute pression sont utilisés pour interconnecter les composants de la pompe, de l’injecteur, de la colonne et du détecteur afin de former le conduit pour la phase mobile, l’échantillon et les bandes de composés séparés.

Le détecteur est relié par un câble à la station de données informatiques, le module du système HPLC qui enregistre le signal électrique nécessaire pour générer le chromatogramme sur son écran et pour identifier et quantifier la concentration des constituants de l’échantillon (voir figure F). Étant donné que les caractéristiques des composés des échantillons peuvent être très différentes, plusieurs types de détecteurs ont été développés. Par exemple, si un composé peut absorber la lumière ultraviolette, un détecteur d’absorbance UV est utilisé. Si le composé est fluorescent, on emploie un détecteur de fluorescence, aussi appelé « fluorimètre ». Si le composé ne présente aucune de ces caractéristiques, on recourt à un type de détecteur plus universel, comme un détecteur évaporatif à diffusion de lumière, ou détecteur DEDL. L’approche la plus efficace consiste à utiliser plusieurs détecteurs en série. Par exemple, on peut employer un détecteur UV et/ou DEDL en combinaison avec un spectromètre de masse pour analyser les résultats de la séparation chromatographique. Cela permet d’obtenir, à partir d’une injection unique, des informations plus complètes sur un analyte. Cette pratique qui consiste à coupler un spectromètre de masse (MS) à un système HPLC est appelée « LC/MS ».

Fonctionnement de la HPLC

Pour comprendre facilement comment nous parvenons à séparer les composés contenus dans un échantillon, consultez l’illustration de la figure G.

La phase mobile entre dans la colonne par la gauche, traverse le lit de particules et sort par la droite. Le sens du débit est représenté par des flèches vertes. Considérez tout d’abord l’image du haut : elle représente la colonne à l’instant zéro (le moment de l’injection), lorsque l’échantillon entre dans la colonne et commence à former une bande. L’échantillon illustré ici, un mélange de colorants jaune, rouge et bleu, apparaît à l’entrée de la colonne sous la forme d’une seule bande noire. En réalité, cet échantillon peut correspondre à tout ce qui peut être dissous dans un solvant ; en général, les composés sont incolores et les parois de la colonne sont opaques, de sorte que nous aurions besoin d’un détecteur pour visualiser les composés séparés lorsqu’ilséluent.

Après quelques minutes (image du bas) pendant lesquelles la phase mobile s’écoule de façon continue et constante devant les particules de la phase stationnaire, nous pouvons constater que les différents colorants se sont déplacés en bandes séparées à des vitesses distinctes. Cela s’explique par le fait qu’il existe une concurrence entre la phase mobile et la phase stationnaire pour attirer chacun des colorants ou analytes. Notez que la bande de colorant jaune se déplace le plus rapidement et est sur le point de sortir de la colonne. Le colorant jaune aime (est attiré par) la phase mobile plus que les autres colorants. Par conséquent, il se déplace plus rapidement, à une vitesse plus proche de celle de la phase mobile. La bande de colorant bleu préfère la phase stationnaire à la phase mobile. Sa plus forte attirance pour les particules ralentit sensiblement son déplacement. En d’autres termes, c’est le composé qui est le plus retenu dans ce mélange d’échantillon. La bande de colorant rouge a une attraction intermédiaire pour la phase mobile et se déplace donc à une vitesse intermédiaire dans la colonne. Étant donné que chaque bande de colorant se déplace à une vitesse différente, nous pouvons la séparer par chromatographie.

Qu’est-ce qu’un détecteur ?

Lorsque les bandes de colorant séparées quittent la colonne, elles passent immédiatement dans le détecteur. Le détecteur contient une cellule de détection qui voit (détecte) chaque bande de composé séparée sur un fond de phase mobile (voir la figure H). En réalité, les solutions de nombreux composés à des concentrations analytiques classiques pour la HPLC sont incolores.Un détecteur approprié a la capacité de repérer la présence d’un composé et d’envoyer le signal électrique correspondant à une station de données informatiques. Il convient d’effectuer un choix parmi de nombreux types de détecteurs différents, en fonction des caractéristiques et des concentrations des composés à séparer et à analyser, comme indiqué précédemment.

Qu’est-ce qu’un chromatogramme ?

Un chromatogramme est une représentation de la séparation qui s’est produite chimiquement (par chromatographie) dans le système HPLC. Une série de pics s’élevant à partir d’une ligne de base est tracée sur un axe temporel. Chaque pic représente la réponse du détecteur pour un composé différent. Le chromatogramme est tracé par la station de données informatiques (voir la figure H).

Sur la figure H, la bande jaune a entièrement traversé la cellule de détection du détecteur ; le signal électrique généré a été envoyé à la station de données informatiques. Le chromatogramme qui en résulte a commencé à s’afficher à l’écran. Notez que le chromatogramme commence lorsque l’échantillon a été injecté pour la première fois et démarre sous la forme d’une ligne droite située près du bas de l’écran. C’est ce qu’on appelle la « ligne de base » ; elle représente la phase mobile pure traversant la cellule de détection au fil du temps. Lorsque la bande d’analyte jaune traverse la cellule de détection, un signal plus fort est envoyé à l’ordinateur. La ligne s’incurve, d’abord vers le haut, puis vers le bas, proportionnellement à la concentration du colorant jaune dans la bande d’échantillon. Cela crée un pic sur le chromatogramme. Lorsque la bande jaune sort complètement de la cellule du détecteur, le niveau du signal revient à la ligne de base ; la cellule de détection ne contient à nouveau que de la phase mobile pure. Puisque la bande jaune se déplace le plus rapidement et élue donc en premier de la colonne, il s’agit du premier pic tracé.

Un peu plus tard, la bande rouge atteint la cellule de détection. Le signal s’élève à partir de la ligne de base à mesure que la bande rouge pénètre dans la cellule et le système commence à tracer le pic représentant cette bande. Dans cette illustration, la bande rouge n’a pas entièrement traversé la cellule de détection. L’illustration montre à quoi ressembleraient la bande rouge et le pic rouge si nous arrêtions le processus à ce moment-là. La majeure partie de la bande rouge ayant traversé la cellule, la majeure partie du pic a été tracée, comme indiqué par le trait continu. Si nous pouvions redémarrer le processus, la bande rouge traverserait complètement la cellule de détection et le pic rouge serait complété (ligne pointillée). La bande bleue, la plus fortement retenue, se déplace à la vitesse la plus lente et élue après la bande rouge. La ligne pointillée montre à quoi ressemblerait le chromatogramme terminé si l’analyse avait été menée jusqu’à sa fin. Il est intéressant de noter que le pic bleu est le plus large, car la largeur de la bande d’analyte bleue, bien qu’elle soit la plus étroite sur la colonne, devient la plus large à mesure qu’elle élue de la colonne. Cela s’explique par le fait qu’elle se déplace plus lentement à travers le lit de la phase stationnaire chromatographique et nécessite plus de temps (et plus de volume de phase mobile) pour être complètement éluée. La phase mobile s’écoulant en continu à un débit fixe, cela signifie que la bande bleue s’élargit et qu’elle est davantage diluée. Comme le détecteur réagit proportionnellement à la concentration de la bande, le pic bleu est plus faible en hauteur, mais plus important en largeur.