Initiation à la chromatographie en phase liquide (LC)

La chromatographie en phase liquide (LC) a été mise au point au début des années 1900 par le botaniste russe Mikhail S. Tswett, véritable pionnier dont les travaux se concentraient sur la séparation de composés (des pigments de feuilles), extraits de plantes à l’aide d’un solvant, dans une colonne garnie de particules.

Tswett remplissait une colonne de verre ouverte de particules. Pour ce faire, deux matériaux en particulier lui ont semblé utiles : la craie en poudre (carbonate de calcium) et l’alumine. Il versait son échantillon (extrait de solvant de feuilles de plantes homogénéisées) dans la colonne pour le faire passer au travers d’un lit de particules, suivi d’un solvant pur. À mesure que l’échantillon descendait par gravité dans la colonne, il voyait apparaître des bandes de couleurs distinctes, car certains composés se déplaçaient plus rapidement que d’autres. Il reliait alors ces bandes de couleurs aux différents composés initialement contenus dans l’échantillon. Il avait créé une séparation analytique de ces composés en fonction de la force d’attraction chimique de chaque composé envers les particules. Les composés les plus fortement attirés par les particules ralentissaient, tandis que les autres composés davantage attirés par le solvant se déplaçaient plus rapidement. Ce procédé peut être décrit comme suit : les composés contenus dans l’échantillon se distribuent, ou se répartissent différemment, entre le solvant en mouvement, appelé « phase mobile », et les particules, dites « phase stationnaire ». Ainsi, les différents composés se déplacent à des vitesses distinctes, ce qui entraîne leur séparation.

Tswett a imaginé le terme de « chromatographie » (du grec chroma, « couleur », et graph, « écriture », soit littéralement écriture en couleur) pour décrire son expérience colorée. (À noter que par pure coïncidence, le nom russe Tswett signifie couleur.)Aujourd’hui, la chromatographie liquide, sous ses diverses formes, est devenue l’un des outils les plus puissants de la chimie analytique. 

Technique 2. À la figure C, les échantillons sont déposés sur du papier (phase stationnaire). Le solvant (phase mobile) est ensuite ajouté au centre de la tache pour créer un écoulement radial vers l’extérieur. Il s’agit d’une forme de chromatographie sur papier. (La chromatographie sur papier classique est réalisée de la même manière que la chromatographie TLC avec écoulement linéaire.)Sur l’image du haut, le même échantillon de colorant FD&C noir est appliqué sur le papier.

Notez la différence de pouvoir de séparation de ce papier par rapport à la plaque TLC. L’anneau vert indique que le papier ne peut pas séparer les colorants jaune et bleu l’un de l’autre, mais il a pu séparer ces colorants du rouge. Sur l’image du bas, un échantillon vert, constitué des mêmes colorants jaune et bleu, est appliqué sur le papier. Comme l’on pouvait s’y attendre, le papier ne peut pas séparer les deux colorants. Au milieu, un échantillon violet, constitué de colorants rouge et bleu, a été appliqué sur le papier. Ils sont bien séparés.

Technique 3. Dans cette approche, la plus efficace, l’échantillon traverse une colonne ou une cartouche contenant les particules appropriées (phase stationnaire). Ces particules constituent le matériau de remplissage chromatographique. Le solvant (phase mobile) traverse le dispositif. En extraction en phase solide, ou SPE, l’échantillon est chargé sur la cartouche et le flux de solvant l’entraîne à travers le dispositif. Comme dans l’expérience de Tswett, les composés de l’échantillon se séparent ensuite en se déplaçant à différentes vitesses dans le dispositif. Ici, l’échantillon de noir est chargé sur une cartouche. Des solvants différents sont utilisés à chaque étape pour créer la séparation.

Il existe plusieurs façons d’obtenir un débit selon le format de la cartouche. La gravité ou le vide peut être utilisé(e) pour les colonnes qui ne sont pas conçues pour résister à la pression. En général, les particules ont alors un diamètre plus grand (> 50 µm), de façon à présenter moins de résistance au débit. Les colonnes en verre ouvertes (expérience de Tswett) en sont un exemple. De plus, les petites colonnes en plastique, généralement sous la forme de corps de seringue, peuvent être remplies de particules et servir à préparer des échantillons. C’est ce qu’on appelle l’extraction en phase solide, ou SPE. Dans ce cas, le dispositif chromatographique, appelé cartouche, est utilisé, généralement avec un débit sous vide, pour purifier un échantillon très complexe avant son analyse.

Des granulométries plus petites (< 10 µm) sont nécessaires pour améliorer le pouvoir de séparation. Cependant, comme les plus petites particules affichent une plus grande résistance au débit, une pression plus élevée est nécessaire pour créer le débit de solvant souhaité. Il convient alors d’utiliser des pompes et des colonnes conçues pour résister à des pressions élevées. Lorsqu’une pression modérée à élevée est appliquée pour faire circuler le solvant dans la colonne chromatographique, il s’agit d’une technique de type HPLC.

Qu’est-ce que la chromatographie liquide haute performance, ou HPLC ?

L’acronyme HPLC, créé par feu le professeur Csaba Horváth dans son article du Pittcon de 1970, indiquait à l’origine qu’une pression élevée servait à générer le débit nécessaire à la chromatographie liquide dans des colonnes garnies de particules. Au début, les pompes n’avaient qu’une capacité de pression de 500 psi, soit 35 bar. Cette technique fut baptisée « chromatographie liquide haute pression », ou HPLC. Au début des années 1970, des progrès technologiques considérables ont permis de grandes avancées, et les nouveaux instruments HPLC ont alors pu développer jusqu’à 6 000 psi (400 bar) de pression et ont intégré des injecteurs, des détecteurs et des colonnes améliorés. La HPLC a réellement commencé à s’imposer entre le milieu et la fin des années 1970. Si la technique s’est continuellement améliorée pendant cette période (particules plus petites, pression encore plus élevée), le sigle HPLC est resté identique, mais sa signification a changé pour désormais correspondre à « High Performance Liquid chromatography », soit « chromatographie liquide haute performance ».

La chromatographie liquide haute performance est à présent l’un des outils les plus puissants de la chimie analytique. Elle permet de séparer, d’identifier et de quantifier les composés présents dans tout échantillon pouvant être dissous dans un liquide. Aujourd’hui, des composés à l’état de traces à l’échelle des parties par billion (ppt pour « parts per trillion ») peuvent facilement être identifiés. La HPLC peut être (et est d’ailleurs) appliquée à pratiquement tous les échantillons, tels que des produits pharmaceutiques, des denrées alimentaires, des produits nutraceutiques, des cosmétiques, des matrices environnementales, des échantillons médico-légaux et des produits chimiques industriels.

Qu’est-ce que la chromatographie liquide ultra-performante, ou technologie UPLC ?

En 2004, des avancées significatives en instrumentation et technologie de colonne ont permis d’augmenter de façon spectaculaire la résolution, la vitesse et la sensibilité de la chromatographie liquide. Pour atteindre un nouveau niveau de performance, il a fallu mettre au point des colonnes dotées de particules plus petites (1,7 µm) et des instruments spécialement conçus pour délivrer une phase mobile à 15 000 psi (1 000 bar). Un nouveau système a dû être créé de A à Z pour la chromatographie liquide ultra-performante, désormais connue sous le nom de technologie UPLC.

Aujourd’hui, dans la recherche fondamentale, des scientifiques utilisent des colonnes contenant des particules encore plus petites, de 1 micron de diamètre, et des instruments capables de fonctionner à une pression de 100 000 psi (6 800 bar). Cela donne un aperçu de ce que l’avenir pourrait réserver.